碳源自供给潜流人工湿地中反硝化基因与碳氮比的关系

刘 畅，闻 岳，余雪岑，郭文瑞，周 琪

(同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092)

碳源自供给潜流人工湿地中反硝化基因与碳氮比的关系

刘 畅，闻 岳，余雪岑，郭文瑞，周 琪

(同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092)

本研究构建了4套碳源自供给水平潜流人工湿地装置，以香蒲生物质发酵液作为外加碳源，考察了生物质发酵液投加量(进水碳氮比CODAdd/NO3-N = 1, 2, 3, 4)与植物(Typha latifolia)对反硝化功能基因nirS、nirK和nosZ的影响。结果表明，三种基因在湿地系统中数量级分别为107～108、105和106～107拷贝数/g砾石。生物质发酵液能促进含nirS、nirK和nosZ的微生物生长；植物能促进含nirS、nirK微生物生长。

水平潜流人工湿地；反硝化基因；生物质发酵液；碳源；脱氮

人工湿地(CWs)污水处理技术具有高效、操作简单、维护和运行费用低廉等优点，已广泛地应用于城市污水处理厂二级出水的深度处理[1]。一般而言，反硝化是人工湿地的主要脱氮途径[2-3]。然而，由于污水中可生物降解有机物在处理厂中被大量去除[4]，因此，急需向人工湿地中补充足够的碳源以提高系统反硝化效能。

张长城等开发了一个碳源自供给的人工湿地，将收割的香蒲生物质产酸发酵后投加到自身系统中，可将硝酸盐速率提高0.05～0.54 gN·m-2·d-1，且硝酸盐的去除速率与CODAdd/NO3-N呈现出强烈的正相关性[5]。虽然该研究已取得了阶段性进展，但是反硝化过程中关键的功能基因的检测对于深刻理解碳源投加和微生物之间的关系也是至关重要的。已有研究表明，反硝化过程中的主要基因为亚硝酸盐还原酶功能基因(nirS和nirK，可分别表达含有细胞色素cd1和铜元素的亚硝酸盐还原酶[6])和一氧化二氮还原酶功能基因(nosZ，表达一氧化二氮还原酶[7])，它们的拷贝数可用于分析反硝化微生物的数量和丰度。同时，在张长城[5]等的湿地中，碳源投加和植物存在对于反硝化功能的影响还不得而知。

因此，本研究的主要目的：定量解析碳源自供给人工湿地中反硝化功能基因(nirS,nirK和nosZ)的丰度；识别植物和生物质碳源对反硝化功能基因的影响。

1 实验材料与方法

1.1 生物质发酵液

使用取自实验室附近河道处香蒲(Typha latifolia)生物质(2012年12月)，剪碎至1～1.5 cm，水洗风干，研磨至0.15 mm(100目)后置于40 ℃烘箱中烘干至恒重。设置5套有效容积为10 L的发酵罐，配备有搅拌桨和温度自动控制器。接种污泥取自上海市某污水处理厂(缺氧-好氧工艺)的回流污泥泵房。生物质发酵期间，需投加微量元素、无机盐以及维生素等，其余操作细节在之前的研究中已经给出[5]。连续发酵20 d后，取出发酵液，在11000 r/min的转速下离心10min后将上清液保存于4 ℃的冰箱中待用。经检测，该生物质发酵液中可利用碳源的主要成份是VFAs(86.2%)，其中，乙酸在VFAs中含量最高(62.3%)[5]。

1.2 装置设计与运行

温室采用玻璃材质以保证充足的阳光，室内温度通过空调维持在(25 ± 2)℃。设置4套水平潜流人工湿地装置，材质为PVC，尺寸：长1.5 m、宽0.4 m、高0.6 m，砾石基质(φ8～13 mm)填充高度h = 0.5 m，有效水深0.45 m，基质孔隙率为0.4。采用连续进水方式，水力停留时间(HRT)为4 d。每个湿地含进水区(0.15 m)，工作区(1.2 m)，出水区(0.15 m)。取样管布设在进、出水区及湿地1/4、1/2和3/4长度处。分别为不种植香蒲和不投加生物质发酵液(Wl)、种植香蒲(20株/m2)和不投加生物质发酵液(W2)、不种植香蒲和投加生物质发酵液(W3)和种植香蒲(20株/m2)和投加生物质发酵液(W4)。在污水处理厂二级出水流入人工湿地前，先用KNO3溶液(100 g·L-1)将进水硝酸盐浓度调节至15 mg·L-1，然后用蠕动泵将发酵液混入并抽入人工湿地，以达到调控W3和W4系统CODAdd/NO3-N分别为1、2、3和4的目的(本研究中的CODAdd/NO3-N指通过投加生物质发酵液增加的进水COD浓度与进水NO3-N浓度的比值，每个工况运行45 d)。

1.3 DNA 提取

四个工况结束后，分别在湿地系统四等分处采集砾石样品200 g，并将不同深度(距系统基质顶层下方5 cm、20 cm和40 cm)的样品混合。将砾石以225 r/min振荡3 h，使样品附着的生物膜充分浸提出来。将浸提液移至离心机中以5000 r/min离心20min，收集沉淀，上清液重复浸提一次。采用FastDNASPIN Kit for Soil(MPBiomedicals,Illkirch,法国)对样品进行DNA 提取。

1.4 Real-Time PCR 分析

表1 Real-Time PCR引物设计信息[8]

分别利用引物nirSCd3aF/nirSR3cd，nirK876/nirK1040和nosZ2F/nosZ2R对反硝化功能基因nirS、nirK和nosZ进行定量分析(引物信息见表1)。本研究采用两步扩增，PCR 循环条件如下：95℃保持3min；循环40 次：95℃保持15 s，57℃保持20 s，72℃保持30 s。完成上述步骤后，把加好样品的96/384 孔板置于LightCycler 480 Software Setup(Roche 罗氏)中进行反应。利用10倍梯度稀释构建好的各质粒用于制备标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 总细菌及反硝化各功能基因

湿地系统在不同运行工况下其基质的总细菌16S rRNA 基因拷贝数以及反硝化各功能基因拷贝数见图1。由图1a可知，在湿地系统中，未投加生物质发酵液的W1和W2系统的总细菌16S rRNA 的拷贝数分别为2.21×108拷贝数/g砾石和2.34×108拷贝数/g砾石，在W3和W4系统中，随CODAdd/NO3-N由1升至4，其值从3.46～3.65×108拷贝数/g砾石增大至8.15～8.21×108拷贝数/g砾石，分别是W1和W2系统的1.63～3.84倍和1.56～3.51倍，这是由于生物质发酵液中的可利用碳源的增加为微生物的生长提供了有利的条件[9]。

又由图1b可知，反硝化细菌在总细菌中所占比例范围为21.2%～50.9%，与过往研究接近[10]。以无植物湿地系统为例，进一步分析可知，当CODAdd/NO3-N 由0增至4时，反硝化细菌在总细菌中所占百分比由21.2%逐步升至48.6%。这表明，投加生物质发酵液促进反硝化细菌在总细菌群体的竞争优势，且随投加量增大优势也增大。这是因为，生物质发酵液中可利用碳源的主要成份是VFAs(86.2%)、糖类(2.2%)和蛋白质(4.3%)等易于被微生物利用的有机物，利于反硝化细菌生长[5]。同时，植物湿地系统也发现了同样的现象，且栽种植物也是提升反硝化细菌在总细菌中优势的有利因素。

图1 湿地基质在不同运行工况下的 (a) 总细菌单位基因拷贝数 (b) ∑nir /总细菌单位基因拷贝数比值 (c) nirS 单位基因 拷贝数 (d) nirK单位基因拷贝数 (e) nosZ 单位基因拷贝数 (f) ∑nir 单位基因拷贝数，∑nir= nirS +nirK (g) nosS/nirK 单位基因拷贝数比值 (h) ∑nir /nosZ单位基因拷贝数比值

2.2 nirS

由图1c可知，在湿地系统中，nirS基因拷贝数的数量级分为107～108拷贝数/g砾石。在无植物系统中，随CODAdd/NO3-N由1增至4，W3的nirS基因拷贝数呈现出明显的递增趋势，说明生物质发酵液碳源对含nirS基因微生物的生长具有促进作用。植物湿地也有上述趋势，此外，栽种香蒲植物对湿地基质上的nirS也有促进作用。与无植物系统相比，植物系统中nirS基因拷贝数基因拷贝数分别提高了49.7%～5.5%，随着CODAdd/NO3-N的增大，植物对其促进作用越小。也说明了生物质发酵液的投加对该类反硝化基因促进作用是主要的，微生物的反硝化作用始终是系统脱氮的主要途径。这与Wen[9]和Chen[11]在以香蒲生物质为外加碳源的批次潜流人工湿地系统中得出的结论一致。

2.3 nirK

由图1 d可知，在湿地系统中，nirK基因拷贝数的数量级为105拷贝数/g砾石。与nirS相同，随着CODAdd/NO3-N由0增至4，湿地系统中nirK基因拷贝数也呈现出明显的递增趋势。同时，植物系统中nirK基因拷贝数较无植物系统提高了124.6%～22.0%，可见栽种植物对湿地基质上的nirK基因拷贝数有促进作用，且植物促进作用随着CODAdd/NO3-N的增大而减小。由图1 g可知，不同工况下湿地中nirS基因拷贝数比nirK基因拷贝数大约高2个数量级，这与过往报道相似[12]。

2.4 nosZ

本试验湿地中，nosZ基因拷贝数要少于∑nir等其它基因的拷贝数，与以往的报道有相同的现象[10,14]。而由图1e，投加生物质发酵液可有利于提高系统内nosZ基因拷贝数。由图1h，观察∑nir/nosZ比值可见，植物湿地系统高于无植物湿地系统。这表明，植物香蒲的存在可能导致温室气体N2O排放量的增加，与Picek T等的研究一致[15]。Cheneby等[16]研究发现，不含nosZ基因的反硝化细菌是植物根系周围最主要的反硝化细菌类型，这从基因水平上揭示了植物增加湿地系统中N2O释放的微观原理。

2.5 碳氮比与反硝化功能基因关系

利用∑nir(∑nir = nirS+nirK)的基因拷贝数可以反映反硝化细菌在系统内的丰度与数量[8,13]。如图1f所示，随着发酵液投加量增大，湿地系统中∑nir拷贝数逐渐增加。在无植物系统中，当CODAdd/NO3-N逐渐增加时，∑nir拷贝数明显多于未投加生物质发酵液湿地系统。这表明，投加生物质发酵液碳源能显著促进反硝化细菌的生长。由图1f还可知，栽种植物也能微弱的促进反硝化细菌生长。

3 结论

结果表明三种功能基因nirS,nirK和nosZ均能在本实验中的连续流潜流人工湿地中检出，其数量级范围是105～108拷贝数/g砾石。生物质发酵液的投加能促进含nirS,nirK和nosZ基因的反硝化细菌增长，而栽种香蒲植物有利于含nirS和nirK基因的反硝化细菌生长。

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(本文文献格式：刘 畅，闻 岳，余雪岑，等.碳源自供给潜流人工湿地中反硝化基因与碳氮比的关系[J].山东化工,2017,46(3):126-129.)

Relationships Between Denitrifying Genes and C/N Ratio in Self-supplying Carbon Source Constructed Wetlands

LiuChang,WenYue,YuXuecen,GuoWenrui,ZhouQi

(College of Environmental Science and Engineering,Tongji University,Shanghai 200092 China)

In this study,four HSSF CWs were set up to investigated the effects of plant fermentation broth ( CODAdd/NO3-N = 1,2,3,4 ) and plants (Typha latifolia) on the denitrification genes. The results showed that the magnitude of copy numbers of the three genes in the wetland systems were 107～108、105and 106～107copies g-1. The addition of fermentation broth could promote the growth of bacteria containing nirS、nirK and nosZ. Typha latifolia enhanced the growth of bacteria containing nirS and nirK.

horizontal subsurface flow constructed wetlands (HSSF CWs); denitrifying genes; plant litter leachate; carbon source; nitrate removal

2016-12-17

国家自然科学基金资助项目(51378372)

刘 畅(1991—)，女，硕士，主要从事污水处理理论与技术研究。

X703.1

A

1008-021X(2017)03-00126-04