一种快速提取南瓜大群体基因组DNA的方法

李 委 戴祖云 夏伟伟 王雯雯

（1安徽江淮园艺种业股份有限公司，安徽合肥230031；2安徽农业大学园艺学院，安徽合肥230061）

一种快速提取南瓜大群体基因组DNA的方法

李 委1，2戴祖云1夏伟伟1王雯雯1

（1安徽江淮园艺种业股份有限公司，安徽合肥230031；2安徽农业大学园艺学院，安徽合肥230061）

基因型鉴定是作物分子标记辅助育种和基因功能遗传分析中十分重要的环节，此项技术的应用正日渐频繁，因而迫切需要一种高通量筛选的方法。本试验以南瓜中筛选到的互补型SSR引物为验证手段，在种子阶段比较了钻孔法和萌芽法采用碱煮法提取DNA的效果，并且在成熟植株阶段验证了各组织部位采用碱煮法提取DNA的效果。结果表明：使用萌芽的南瓜种子根尖以碱煮法提取DNA是可用于种子纯度测定的快速方法；成熟植株各部位采用碱煮法提取DNA均可用于植株基因型筛选。

南瓜；基因型鉴定；分子育种；碱煮法

南瓜（Cucurbita moschata Duch. ex Poir.）作为一种重要的经济作物，近年来受到越来越多研究者的重视。早在2009年国际葫芦科遗传学会年报上就发表了南瓜中的136个性状或生化控制基因，以及部分性状的连锁分子标记的研究结果（Paris & Kabelka，2009）。随着分子生物学的迅速发展，南瓜作物上有越来越多的分子标记被开发出来，研究者试图通过分子生物学手段来完成南瓜的种质亲缘关系确立、杂交种纯度测定、遗传图谱构建等工作（Paris et al.，2003；朱海生 等，2015）。而以上种种技术均依赖于DNA的大批量提取，传统的CTAB提取法耗时耗力且会使用到有毒试剂（赵茜和徐丽珍，2011；王迎儿 等，2015）。近年来碱煮法被广泛应用于玉米、小麦、大豆等作物的DNA提取（王伟威 等，2008；郑淑波 等，2015），同时还有研究者尝试将种子钻孔法和碱煮法结合起来，建立一种无损提取DNA的方法（程文 等，2016）。

目前在南瓜上进行的分子标记工作众多，但大多采用传统提取方法（李鹤 等，2014；朱海生 等，2015），尚未有碱煮法提取的报道。本试验分别在种子和成熟植株两个阶段验证了碱煮法所提DNA用于SSR-PCR的效果，尝试解决南瓜植株的高通量筛选问题，以期为分子育种技术的优化提供 参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为安徽江淮园艺种业股份有限公司提供的南瓜品种江蜜8号及其父本L-817、母本玉-041，种子于2016年10月采集自安徽合肥长丰县吴山镇江淮园艺农业示范园区。

试验所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 DNA提取

CTAB法提取DNA参照王瑞等（2011）的方法。碱煮法参照郑淑波等（2015）、程文等（2016）的方法，稍有改动。钻孔法：采用微型电钻在南瓜种子上打孔，钻取出来的子叶粉末落在纸上后，小心移入96孔PCR板中，钻孔后的种子留存备用；使用75%乙醇清洁钻头，以吸水纸擦拭干净，然而处理下一个样品；待收集完后，每孔加入0.2 mol·L-1NaOH溶液30 μL，置入PCR仪中，99 ℃处理10 min，然后每孔再加入1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH=6.0）30 μL，轻轻混匀后2 500×g离心30 s，吸取上清作为模板进行后续PCR检测。萌芽法：在种子生出芽根后，截取根尖约1 cm长的组织，放入96孔PCR板中，每孔加入0.2 mol·L-1NaOH溶液80 μL，置入PCR仪中，99 ℃处理30 min，然后每孔再加入1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH=6.0）80 μL，轻轻混匀后2 500×g离心30 s，吸取上清作为模板进行后续PCR检测。

1.3 PCR检测

PCR反应体系（20 μL）：1×PCR Buffer 1 μL，200 μmol·L–1dNTPs 1 μL，0.5 μmol·L–1引物2 μL，1 U Taq DNA Polymerase（康为世纪公司）0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；72 ℃延伸2 min。PCR产物中加入上样缓冲液2 μL，于3%琼脂糖凝胶中电泳。引物序列为CMTm224F：GTGGGTCGCTCCTTAAA，CMTm224R：ATAGCGGATAAAGTGGACTG；引物由Invitrogen公司合成。筛选所用的引物库为Gong等（2008）公布的200对SSR引物。

1.4 发芽试验

随机取钻孔后的种子和完整种子各100粒，浸种4 h后置于30 ℃催芽箱内，3 d后统计出芽率；3次重复。同时，取根长约3 cm的种子播于基质 〔每立方米基质含草炭0.75 m3，蛭石0.13 m3，珍珠岩0.12 m3，石灰石3.0 kg，过磷酸钙（20% P2O5）1.0 kg，三元复合肥（N∶P∶K=15∶15∶1）1.5 kg，消毒干鸡粪10 kg〕中，出苗10 d后测定株高，每处理随机测定20株，取平均值；3次重复。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及序列比对

以江蜜8号及其父母本为试材，首先采用传统CTAB法提取DNA为模板，经过筛选，确定CMTm224为双亲互补型引物对。如图1所示，CMTm224引物对在父本中可扩增出1条141 bp大小的条带；在母本中可扩增出1条123 bp大小的条带；在一代杂种中可扩增出2条条带，大小分别为141 bp和123 bp。经过测序比对（图2），父、母本在该位点的重复基序均为CT（n），且除重复基序的长度不同外，其余序列十分相似。经NCBI网站比对，父、母本序列的相似度为96%。

图1 江蜜8号及其父母本PCR检测结果

图2 江蜜8号父、母本序列比对结果

2.2 两种取材方法的比较

参照程文等（2016）的方法，从单粒南瓜种子上以钻孔法获取组织材料；另外，从萌芽的南瓜种子上取根尖材料。采用碱煮法提取DNA，以CMTm224为引物进行PCR检测。结果如图3所 示，采用钻孔法提取DNA，父本和母本均可扩增出清晰的条带，而一代杂种的条带较模糊；采用萌芽法提取DNA，父母本与一代杂种均可扩增出清晰的条带。

图3 钻孔法与萌芽法提取DNA的PCR检测结果

从表1可以看出，不同取材方法对南瓜种子的发芽率无显著影响，但株高和简易活力指数两处理间差异达显著水平。

表1 不同取材方法对南瓜种子活力的影响

2.3 不同体积Tris-HCl缓冲液对DNA提取的影响

为验证碱煮法中所加Tris-HCl缓冲液的作用，设加入80、40、4 μL Tris-HCl缓冲液3个处理，分别提取DNA作为模板进行PCR检测。如图4所示，80 μL 和40 μL Tris-HCl缓冲液处理的DNA模板均扩增出清晰条带，而4 μL Tris-HCl缓冲液处理的DNA模板未能扩增出条带。由表2可知，这3组DNA的浓度分别为479、711、886 ng·μL-1；OD260/OD280的比值从1.60递减至1.51，OD260/OD230的比值处于0.7～0.8区间内，表明随着加入Tris-HCl缓冲液体积的减少，所得DNA中的蛋白质、糖类及盐类等杂质逐渐增多；pH值的变化最为明显，80 μL Tris-HCl缓冲液处理和40 μL Tris-HCl缓冲液处理的pH值分别为7.0和7.4，而4 μL Tris-HCl缓冲液处理则达到了9.8。

图4 不同体积Tris-HCl缓冲液提取DNA的PCR检测结果

表2 不同体积Tris-HCl缓冲液对提取DNA质量的影响

2.4 成熟植株各组织部位所提DNA的PCR检测结果

为验证成熟植株各组织部位对于碱煮法提取DNA的适应性，分别切取江蜜8号及其父母本植株根、茎、叶、花瓣、花蕊、果实，采用碱煮法提取DNA，以CMTm224为引物进行PCR检测。结果如图5所示，南瓜成熟植株各组织部位所提DNA均可扩增出清晰条带。可见在成熟植株的基因型鉴定中亦可选取易于得到的组织部位，使用碱煮法完成DNA提取。

图5 成熟植株各组织部位所提DNA的PCR检测结果

2.5 南瓜幼苗SSR-PCR鉴定结果

为验证碱煮法在批量鉴定中的应用情况，从田间随机选取100株江蜜8号植株进行顺序编号，采用碱煮法提取DNA，进行SSR-PCR检测。结果如图6所示，21号、27号和77号均被鉴定为母本植株。经田间表型观察，21号、27号和77号这3株植株叶型小、始终短蔓簇生，为母本植株的表型性状；除这3株外，其余植株叶型偏大、近根处为短蔓簇生、5节左右以后变为长蔓，为一代杂种的表型性状。由此可以验证碱煮法适用于大批量的成熟植株基因型筛选。

图6 南瓜幼苗SSR-PCR鉴定结果

3 结论与讨论

近年来，以南瓜为研究对象，采用集团分离分析法、近等基因系法与SSR、ISSR等标记技术相结合，筛选出了一系列与功能性状相连锁的分子标记（王瑞 等，2011；王冬杰 等，2014）。其中王瑞等（2011）报道了1个AFLP标记，该标记与南瓜短蔓基因之间存在连锁关系。而本试验中所用江蜜8号的母本即为短蔓，至于采用的CMTm224标记是否也与短蔓基因存在连锁关系，尚需更深入的研究。另外，进一步扩大引物的筛选范围，或者使用更高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶进行筛选，均是下一步可能的工作计划。

近年来，关于从南瓜中提取DNA进行后续研究的报道很多，但多为使用传统CTAB或SDS方法，其弊端为使用到氯仿等有毒试剂或是操作步骤较繁琐，难以应对大批量筛选。与此同时，一种快速有效的碱裂解法正被越来越多的应用到花生、玉米、小麦和水稻等作物的转基因植株鉴定和分子标记辅助育种上（Xu et al.，2005；Collard et al.，2007）。采用碱裂解法提取的DNA含有蛋白质、糖类等杂质，且有可能造成长片段断裂等问题；但是由于SSR等分子标记技术所涉及到的片段一般很小，大多在200 bp左右，且对于PCR模板的质量要求也不严苛，因此反而适宜使用快捷的碱煮法。本试验以萌发种子的根尖和成熟植株的各组织器官作为材料，进行了碱煮法提取DNA效果的对比测试，证实了使用各部位的植物材料，配以碱煮法进行提取，所得到的DNA完全能够满足分子标记的扩增要求，同时整个操作的成功率高、效 率好。

另外，在碱煮法的基础上，近年来许多研究者尝试建立各种植物种子的无损基因型鉴定技术（郑淑波 等，2015；程文 等，2016）。本试验证实，通过钻孔小心获取子叶的少量材料，所提取的父母本DNA可通过后续PCR产生清晰条带，但一代杂种所产生的条带稍显模糊，推测这可能与操作中材料污染有关。同时钻孔后种子的萌发率与未钻孔相比，没有显著差异，因而总体上可以认为钻孔法基本能满足基因型鉴定和种子后续萌发的双重需求。试验过程中南瓜种子在被钻取后进行催芽，有一部分出现了发霉的现象。郑淑波等（2015）曾对切除胚乳的玉米种子进行包衣以提高其活力，取得了成功，因此这一问题也许可以通过对种子进行包衣得到解决。

但是，上述方法也存在无法应用高通量筛选的问题，譬如获取子叶材料的过程中，由于种皮来源于母体，故需先用砂纸磨掉一块种皮后再钻孔取样，以防母体DNA的污染。再加上每取完一粒种子后钻头需彻底清洁掉其上的粉末，否则也极易污染其他样品，因此该方法在速度上无法得到提升，并不适用于大批量鉴定的情况。因此建议在测定种子纯度时，使用萌芽法取根尖组织以碱煮法提取DNA后配合SSR-PCR来进行纯度测定。而在进行转基因植株筛选的时候，从幼苗上取嫩叶以碱煮法提取DNA可能会是比较便捷的 途径。

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A Rapid DNA Extraction Method for Large Squash Population

LI Wei1，2，DAI Zu-yun1，XIA Wei-wei1，WANG Wen-wen1

（1Anhui Jianghuai Horticulture Seed Co. Ltd.，Hefei 230031，Anhui，China；2College of Horticulture，Anhui Agricultural University，Hefei 230061，Anhui，China）

Genotype identification is an important link in molecular-marker-assisted breeding and genetic analysis of gene function．Since this method is used more and more frequently，researchers need a high-throughput technique．This experiment took a pair of SSR primers of complementary type as the method，and compared the effect of extracting DNA from cotyledon and root during seedling stage．The effect of extracting DNA from each tissue of the plant by NaOH-boiling method during maturing stage was also verified．The results indicated that extracting DNA from root with NaOH-boiling method was a rapid way to measure seed purity．Therefore，extracting DNA with NaOH-boiling method from all tissues of the matured plant could be used for screening plant genotype．

Squash；Genotype identification；Molecular breeding；NaOH-boiling method

李委，男，博士，讲师，专业方向：分子遗传学，E-mail：childelee@126.com

2017-02-04；接受日期：2017-07-03

安徽省科技攻关计划项目（1501142220）