3种芝麻蛋白结构和性质比较研究

张国治,袁东振，芦 鑫，张问夕，黄纪念

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001； 2.河南省农科院 农副产品加工研究所，郑州 450002；3.天津利金粮油股份有限公司，天津 300112)

3种芝麻蛋白结构和性质比较研究

张国治1,袁东振1，芦 鑫2，张问夕3，黄纪念2

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001； 2.河南省农科院 农副产品加工研究所，郑州 450002；3.天津利金粮油股份有限公司，天津 300112)

采用SDS-PAGE电泳、傅里叶红外光谱、氨基酸组成分析对亚临界芝麻粕、天然芝麻和高温芝麻粕中提取的分离蛋白的结构和性质进行了比较研究。结果表明：亚临界芝麻蛋白(SPSI)和天然芝麻蛋白(NSPA)的亚基组成与分布基本一致，高温芝麻蛋白(SPHS)与前两种芝麻蛋白的结构有明显的差异，高温造成SPHS缺失NSPA的典型亚基，这会影响其性质和应用范围；SPSI、NSPA和SPHS在酰胺III带的吸收峰分别在1 235、1 237 cm-1和1 240 cm-1；SPSI与NSPA的氨基酸组成基本一致，且相比SPHS的氨基酸配比更符合FAO推荐值；SPSI具有较好的溶解性、吸水性、吸油性、乳化性、乳化稳定性和泡沫稳定性。从亚临界芝麻粕提取的芝麻蛋白的结构破坏程度低，营养价值较高并且功能性好，更适宜作为食品原料。

芝麻分离蛋白；亚基；结构；性质

芝麻是我国重要的油料作物，其中含有20%～25%的蛋白质。目前，我国芝麻大部分用于榨油，芝麻饼粕大多用作肥料、动物饲料，尚未进行深加工，造成大量蛋白质资源的浪费。芝麻蛋白主要由水不溶性11S球蛋白(60%～70%)和可溶性蛋白2S白蛋白(25%)组成，分别被命名为α-球蛋白和β-球蛋白[1]。芝麻蛋白营养价值较高，其净蛋白质利用率(NPU)为56，蛋白质功效比值(PER)为1.8[2]。因此，如何有效利用芝麻饼粕，进一步提高芝麻蛋白的深加工水平，开发芝麻蛋白应用领域，成为研究的重点。

本文主要对亚临界芝麻粕、高温芝麻粕和天然芝麻中提取的分离蛋白的结构和性质进行了比较研究，旨在为开发具有不同功能特性的芝麻蛋白提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

芝麻：河南平舆康博汇鑫油脂有限公司提供；高温芝麻粕：河南省农科院农副产品加工研究所提供；大豆油：益海嘉里粮油工业有限公司。

溴酚蓝、巯基乙醇、考马斯亮蓝R250、丙烯酰胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸：美国Amresco公司；硫酸铜、硫酸钾、硼酸、盐酸、硫酸、氢氧化钠、冰乙酸、甲醇、石油醚，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；K-05型全自动凯氏定氮仪；SOX406脂肪测定仪；DGX-9243型鼓风干燥箱；Lyovac GT1型冷冻干燥机：德国SRK公司；DL-5-B离心机；DS-1型高速组织捣碎机；TGL20M-Ⅱ高速离心机、XS205电子天平、FE20实验室pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DYCZ-24DN型电泳槽；DYY-12型电泳仪；WD-9405B脱色摇床；Nicolet IS5傅里叶红外光谱仪：赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 3种芝麻蛋白的制备

亚临界芝麻蛋白(SPSI)：芝麻经粉碎后，以液化气为萃取剂，在亚临界状态下，固定萃取次数3次、压力1.0 MPa、温度50℃、料液比1∶3及时间2 h进行芝麻油萃取，固液分离后得到亚临界芝麻粕。以此粕为原料，经过粉碎，脱脂处理后，在pH 10.5、温度45℃、液固比18∶1、时间20 min的条件下，提取芝麻蛋白，在-20℃预冻2 h，最后经过真空冷冻干燥处理，得到亚临界芝麻蛋白成品。

天然芝麻蛋白(NSPA)：以芝麻为原料，经过粉碎、脱脂处理后，在pH 9.5、温度40℃、液固比 20∶1、提取时间60 min的条件下，提取芝麻蛋白，在-20℃预冻2 h，最后经过真空冷冻干燥处理，得到天然芝麻蛋白成品。

高温芝麻蛋白(SPHS)：以高温芝麻粕为原料，经过粉碎、脱脂处理后，在pH 12、温度40℃、液固比20∶1、提取时间90 min的条件下，提取芝麻蛋白，在-20℃预冻2 h，最后经过真空冷冻干燥处理，得到高温芝麻蛋白成品。

1.2.2 芝麻蛋白主要成分的测定

水分的测定：参照GB 5009.3—2010；粗蛋白质的测定：参照GB 5009.5—2010；灰分的测定：参照GB 5009.4—2010；粗脂肪的测定：参照GB 5009.6—2003；氨基酸分析：参照GB/T 5009.124—2003。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

借鉴Achouri等[3]的方法，利用SDS-PAGE凝胶电泳测定SPSI、NSPA和SPHS在相对分子质量分布上的差异。采用12%分离胶(pH 8.8)和3%分离胶(pH 6.8)，芝麻蛋白样品溶解于0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液中，沸水加热5 min以使芝麻蛋白变性，8 000 r/min离心，上样8 μL，凝胶电泳于恒流下进行，在浓缩胶中电流为10 mA，进入分离胶后增至20 mA。凝胶以质量分数为0.1%的考马斯亮蓝R250染色2 h，最后用含10%(体积分数)甲醇和10%(体积分数)冰乙酸的脱色液脱色10 h后，于凝胶成像系统进行成像处理[4]。

1.2.4 红外光谱分析

将样品干燥后，分别取样品1 mg与100 mg溴化钾粉末研磨混匀，压制成薄片，在傅里叶红外光谱仪上做全波段(400～4 000 cm-1)扫描测定，以KBr作为空白。

1.2.5 氮溶解指数的测定

参照AACC 46-23进行氮溶解指数的测定。分别准确称取5 g(换算后纯蛋白质的质量)芝麻蛋白(SPSI、 NSPA、 SPHS)样品，置于3个400 mL烧杯中，用量筒量取200 mL 30℃的蒸馏水，分几次加入到烧杯中，样品混合后将其浸在30℃水槽中，120 r/min 搅拌120 min，在搅拌过程中不断调节pH为7，最后将混合物转到250 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，静置5 min，取40 mL于50 mL离心管中在8 000 r/min离心20 min，随后采用微量凯氏定氮法测定上清液中可溶解氮质量(N1)和样品总氮质量(N0)。

氮溶解指数(NSI)的计算公式如下：

NSI=N1/N0×100%

1.2.6 吸水性及吸油性的测定

参照文献[5]测定。

1.2.7 乳化性及乳化稳定性的测定

参照文献[6]测定。

1.2.8 起泡性及泡沫稳定性的测定

参照文献[7]测定。

1.2.9 数据处理

试验平行测定3次。采用SAS 9.1.3分析和处理数据。P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 3种芝麻蛋白的主要成分(见表1)

表1 3种芝麻蛋白的主要成分 %

注：同列不同字母代表差异显著(P<0.05)。

由表1可知，SPSI与NSPA的组成成分没有显著性差异；SPHS的粗蛋白质含量低于前两者，而粗脂肪、灰分和水分含量高于前两者。

2.2 SDS-PAGE电泳分析(见图1)

注：M.标准蛋白；1.SPSI；2.NSPA；3.SPHS。

图13种芝麻蛋白的SDS-PAGE图谱

由图1可知，SPSI和NSPA的亚基组成基本一致，说明亚临界工艺条件比较温和，对粕中蛋白质的结构影响比较小。而SPHS中已经没有天然芝麻蛋白的典型亚基，主要亚基组成是在200 kDa左右，原因可能是高温芝麻粕在加工过程中受到高温的影响，大部分蛋白质发生聚集现象，通过共价键重新组合成相对分子质量较大的条带。

2.3 傅里叶变换红外光谱分析(见图2)

由图2可知，3种芝麻蛋白的红外光谱图基本一致。酰胺A是由N—H伸缩振动产生的，其吸收峰通常在3 400～3 440 cm-1之间。而SPSI、NSPA和SPHS的酰胺A吸收峰分别为3 304、3 373 cm-1和3 396 cm-1，这是因为当含有N—H基团的分子肽段参与氢键的形成时，N—H的伸缩振动会向低频率移动[5]，这也表明3种芝麻蛋白中存在氢键。

酰胺B是由饱和结构中CH3和CH2基团的C—H 伸缩振动产生的，在2 850～2 980 cm-1波段有吸收峰[6]。由图2可知，SPSI、NSPA和SPHS 3种芝麻蛋白的吸收分别在2 960、2 958 cm-1和2 961 cm-1，符合酰胺B的特征吸收。

多糖分子存在C—OH基团，因此在1 000～1 100 cm-1之间会出现C—O伸缩振动峰[10]，而SPSI和NSPA特征吸收峰分别是1 076 cm-1和1 096 cm-1，而SPHS在此没有特征吸收峰。

图2 3种芝麻蛋白的红外光谱图

2.4 氨基酸组成分析(见表2)

表2 3种芝麻蛋白的氨基酸组成 g/100 g

由表2可知，SPSI和NSPA的氨基酸组成基本接近，富含8种必需氨基酸，其苏氨酸、丝氨酸、胱氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸的含量明显高于SPHS中的含量。由此可见，亚临界萃取工艺对芝麻蛋白的影响比较小；而高温条件下，芝麻粕中的蛋白质可能发生了变性。相比于FAO氨基酸推荐标准，SPSI中的苏氨酸、组氨酸和精氨酸明显高于其推荐值。所以，亚临界芝麻蛋白相比于高温芝麻蛋白更具有利用的价值。

2.5 3种芝麻蛋白功能性质的比较(见表3)

表3 不同芝麻蛋白的功能性质比较

注：同行不同字母代表差异显著(P<0.05)。

由表3可知， SPHS的NSI最低，是因为受到高温的影响，芝麻蛋白变性程度较大，疏水基团外露，增加了表面疏水性，造成NSI降低。一般情况下，组成蛋白质的非极性氨基酸侧链分布于分子内部，形成疏水性内核；而极性氨基酸分布在蛋白质的外围，形成亲水的表面。由于SPSI和NSPA没有经过高温过程，所以它们的NSI要高于SPHS。SPSI和NSPA的吸水性和吸油性无显著性差异，SPHS的吸水性弱可能因为高温使蛋白质的疏水性氨基酸侧链暴露，导致其吸水性最弱；而SPHS的吸油性弱可能因为在高温过程中蛋白质发生了不可逆转的变性，疏水基团受到破坏，导致其吸油性最低。

蛋白质是两亲结构，由亲水的表面和疏水的核心组成，这种特殊的结构决定了芝麻蛋白具有乳化性。相比于SPSI和NSPA，SPHS具有较好的乳化性和乳化稳定性。因为SPHS在高温过程中发生较大变性，空间结构受到破坏，大量疏水基团外露，NSI降低，但在某种程度上增加了蛋白质和油的结合能力，与SPSI、NSPA相比较，可能更容易使乳化体系趋于稳定。

研究表明，蛋白质的起泡性与其结构之间有着密切的关系。起泡性较好的蛋白质，其分子柔韧性较好，并能快速在界面上吸附并展开，降低表面张力；而分子呈高度有序排列的球蛋白，分子柔韧性较差，其起泡能力相对较差[11-14]。SPHS的起泡性优于SPSI、NSPA，但泡沬稳定性较差于后两者。原因可能是因为SPHS在高温作用下，蛋白质分子肽链重新展开，其柔韧性增强，蛋白质分子向气水界面的迁移速率得到提升，因此改善了其起泡性。而又因为蛋白质的起泡能力和稳定性可能受不同的两组蛋白质性质的影响，而这两组性质彼此是对抗的，因此SPHS泡沫稳定性较差。

3 结 论

(1)SDS-PAGE电泳分析结果表明：亚临界芝麻蛋白(SPSI)和天然芝麻蛋白(NSPA)的亚基组成与分布基本一致，高温芝麻蛋白(SPHS)与SPSI、NSPA的组成有明显的差异，高温造成SPHS缺失天然芝麻蛋白的典型亚基，这会影响其性质和应用范围。通过红外谱图分析可知，SPSI、NSPA、SPHS在酰胺Ⅲ带的吸收峰分别在1 235、1 237、1 240 cm-1。氨基酸组成分析结果表明，SPSI与NSPA的氨基酸组成基本一致，且较SPHS的氨基酸配比更符合FAO推荐值。

(2)对3种芝麻蛋白性质的比较发现，SPSI具有较好的溶解性、吸水性、吸油性、乳化性、乳化稳定性和泡沫稳定性，并且SPSI与NSPA的功能性质基本一致，说明亚临界萃取工艺对芝麻粕中蛋白质的损害较小。由于高温作用导致SPHS的功能性质较差，不利于蛋白质的深加工和利用。

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Comparisonofstructureandpropertiesofthreekindsofsesameproteins

ZHANG Guozhi1，YUAN Dongzhen1，LU Xin2，ZHANG Wenxi3，HUANG Jinian2

(1. School of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 3. Tianjin Lijin Grain and Oil Co., Ltd., Tianjin 300112,China)

The differences in structure and properties of supercritical sesame protein(SPSI), natural sesame protein (NSPA) and high temperature sesame protein(SPHS) were comparatively studied by SDS-PAGE electrophoresis, FTIR and amino acid composition analysis. The results showed that there was no difference in the composition and distribution of subunits of SPSI and NSPA. While the structure of SPHS was different from the above sesame proteins, and the typical subunits of the NSPA were lost because of high temperature, which would affect its properties and application range. The amide III band absorption peaks of SPSI, NSPA and SPHS were at 1 235, 1 237 cm-1and 1 240 cm-1respectively. Amino acid compositions of SPSI and NSPA were basically the same, and the amino acid ratio was more in line with the FAO recommended values than SPHS. SPSI had good solubility, water absorption, oil absorption, emulsifying ability, emulsion stability and foam stability. The level of structural damage was low in the protein which was extracted from subcritical sesame meal, and it was more suitable as a food ingredient because of the highly nutritional value and functional property.

sesame protein isolate; subunit; structure; property

2016-11-25

河南省农业科学院科研发展专项资金项目(201315614)

张国治(1964)，男，教授，硕士生导师，研究方向为食品资源开发与利用(E-mail)zgzhi11@163.com。

TS229；TQ936.2

：A

：1003-7969(2017)07-0055-05