云南10种中草药水煎剂对猪源大肠杆菌体外抑菌实验

刘永波，舒相华，白华毅，陶 杨，谢相悦，吴常月，张 雪，李 鑫，凌万旭，何 锦，宋春莲

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；2.昆明伟牧得生物科技有限公司，昆明，650201）

云南10种中草药水煎剂对猪源大肠杆菌体外抑菌实验

刘永波1，舒相华1，白华毅1，陶 杨1，谢相悦1，吴常月1，张 雪1，李 鑫1，凌万旭2，何 锦2，宋春莲1

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；2.昆明伟牧得生物科技有限公司，昆明，650201）

为了研究云南省10种中草药水煎剂对猪源大肠杆菌的体外抑菌作用，用两次煎煮法将黄芩、黄连、黄柏、当归、板蓝根、灯盏花、马蹄香、茯苓、白头翁、岩坨等10种云南主产中药材制成生药浓度为1g/ml的水煎液，用牛津杯法测定抑菌圈，试管法测定最小抑菌浓度(MIC)。结果显示当归、黄连、黄芩、白头翁水煎剂体外抑菌效果较好，抑菌圈分别为18、17、16、12cm；MIC分别为250mg/ml、62.5mg/ml、125mg/ml、500mg/ml。该实验所选10种中药材除茯苓和马蹄香外，其余中药材水煎液对猪源大肠杆菌皆有不同程度的体外抑菌效果。该研究对临床应用中草药防治猪大肠杆菌病及筛选效果良好的抑菌中草药物进行抗菌兽药研发有一定的指导意义。

中草药；水煎剂；猪源大肠杆菌；抑菌圈；最小抑菌浓度

大肠杆菌（Escherichia coli），又名大肠埃希氏菌，是肠杆菌科(Ecnterobacteriaceae)埃希氏菌属(Escherichia)的代表菌，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，是人和动物肠道中的正常栖居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌[1]。猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的猪的一种传染病。主要表现为肠炎、肠毒血症等多种临床症状。猪场饲养环境不良、消毒不规范及猪自身的免疫力低下是诱发该病的重要因素。猪大肠杆菌病主要表现为仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病[2]。大肠杆菌的血清型众多，疫苗免疫效果不佳，临床多采用抗菌药物进行治疗，由于近年来抗菌药物的大量不规范应用，该病的抗药性问题日渐严重[3]，研发新型非化学抗菌药物迫在眉睫。

中草药具有副作用小、价格低廉、低耐药性、低残留等优点，应用中草药研发新型抗菌兽药及饲料添加剂成为近年的来热门研究课题[4]。云南地形地貌复杂，气候多样，中草药资源丰富，素有“植物王国、药材之乡”的美称[5]。本研究通过对黄芩、黄连、黄柏、当归、板蓝根、灯盏花、马蹄香、茯苓、白头翁、岩坨等10种云南省主产中草药水煎剂对猪源大肠杆菌进行体外抑菌试验，测定抑菌圈和最小抑菌浓度(MIC)，为兽医临床合理使用中草药防治猪大肠杆菌病和筛中草药进一步研发抗菌兽药提供理论和实验依据。

1 实验材料

1.1 供试药品

供试中草药为：黄连(澄江)、黄芩(昆明)、黄柏(泸西)、当归(曲靖)、茯苓(泸西)、灯盏花(腾冲)、马蹄香(保山)、板蓝根(泸西)、岩陀(大理)、白头翁(昆明)，各药材均为实地采购，括号内备注为采购地点。供试菌为猪大肠杆菌ATCC29522，购于广东省菌种保藏中心

1.2 实验试剂、耗材

LB液体培养基、麦康凯培养基、平板技术培养基、普通营养琼脂、牛肉膏、蛋白胨、革兰氏染色试剂盒、细菌复苏液、一次性无菌平皿(90mm)、牛津杯(6*8*10mm)、一次性移液管(10ml)、一次性吸管(1ml)、离心管(4ml)

1.3 实验仪器

超净工作台 （SW-CJ-1F，苏净集团安泰公司）、恒温水浴锅 (HH-2，邦西仪器科技有限公司)、恒温气浴振荡器(CHA-S，常州智博瑞仪器制造有限公司)、电子天平(HTP312,上海花潮电子仪器有限公司)、恒温生化培养箱(SPX-150，上海申贤恒温设备厂)、立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-30KBS，上海申安医疗器械厂)、电热恒温干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科学仪器有限公司)、电冰箱(BCD-222HE3B，美菱股份有限公司绵阳冰箱制造厂)

2 实验方法

2.1 中草药水煎液的制备

分别称取上述十种中药各50g于1000ml砂锅中，加500ml蒸馏水，浸泡2h，先大火加热至沸腾，后文火煎煮1h，纱布过滤至100ml烧杯中；再加入300ml蒸馏水，煎煮方法同上，合并两次煎煮液，于电热恒温干燥箱干燥至50ml。将中药水煎液移至 100ml规格锥形瓶中，121℃灭菌20min，用已灭菌的蒸馏水重新定容至50ml，即得生药浓度为1g/ml中药水煎液，4℃冰箱保存备用

2.2 供试菌液的制备

2.2.1 向冻干菌种加入复苏液，制成细菌悬浮液，用已灭菌生理盐水50倍稀释，用一次性滴管吸取适量均匀涂布于普通营养琼脂平板上，置于37℃生化培养箱培养24h

2.1.2 挑取单个菌落在麦康凯培养基上划线培养，37℃培养 16h，

2.1.3 挑取单个菌落接种于LB液体培养基试管，置于恒温气浴振荡器37℃培养10h，4℃冰箱保存备用

2.3 中药水煎液抑菌圈测定

2.3.1 配制普通营养琼脂于两个蓝口瓶，分别编号为1和2。121℃高压灭菌20min，置于45℃水浴锅，用一次性10ml规格移液管于1号蓝口瓶中分两次共吸取20ml至每个平板，冷却凝固。(该步骤在无菌室按照无菌操作规程完成)

2.3.2 用2号蓝口瓶中的普通营养琼脂稀释供试菌液浓度至105-106CFU/mL，用5mL一次性移液管分别吸取5mL菌液于已冷却的普通营养琼脂平板培养基上，冷却凝固

2.3.3 将已灭菌的牛津杯用镊子均匀地置于已凝固的普通营养琼脂平板上，每个平板放4个牛津杯。

2.3.4 用一次性吸管吸取各中药水煎液于牛津杯中，每个平板设两孔阴性对照，将已高压灭菌的LB液体培养基用一次性吸管加至阴性对照孔，两对照孔和两中药水煎液孔分别呈对角设置。

2.3.5 将平板置于37℃生化培养箱培养24h，每个平板抑菌圈大小为两孔抑菌圈之和的均值。抑菌圈判定标准为：抑菌圈直径小于10mm为耐药，10-15 mm为中度敏感，大于15 mm为高度敏感[6]。实验设3个重复。

2.3.6 分别在抑菌圈内及圈外挑菌进行革兰氏染色。

2.4 中药水煎液MIC测定

2.4.1 依据各中药水煎液抑菌圈检测结果，选取黄连、当归、黄芩、白头翁做MIC测定

2.4.2 按无菌操作规程分别将黄连、当归、黄芩、白头 翁 配 制 成 500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/m浓度的水煎剂

2.4.3 将已稀释好的各中药不同浓度的水煎剂各取1ml于4ml规格已灭菌离心管内，各中药水煎剂分别设一孔阴性对照，加1ml已灭菌LB普通液体培养基

2.4.4 向每个离心管内加50ul细菌浓度为105-106CFU/ml的猪大肠杆菌菌液

2.4.5 将离心管置于37℃生化培养箱培养24h。分别观察各离心管细菌的生长状况。以不显示浑浊，管内液体清亮的为无菌落生长，该试管的药液稀释度为该中药水煎液对猪大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。每种中药水煎剂实验设置3个重复。

3 实验结果

3.1 中药水煎液抑菌圈实验结果

表1 牛津杯法测定各中草药水煎剂对猪大肠杆菌抑菌圈结果Table1 The bacteriostatic circle of Chinese herbal medicine Water Decoction against swine Escherichia coli which was determined bythe oxford cup method

由表1可知，当归水煎液对猪大肠杆菌具有明显的抑制作用，其次为黄连、黄芩、白头翁水煎液。挑取抑菌圈内进行革兰氏染色，显微镜下视野可见无菌或几个零星散在菌落，表明抑菌圈内药物可以抑制猪大肠杆菌的生长繁殖。茯苓水煎三个重复实验组平板上皆未出现明显的抑菌圈，表明该药物水煎液对猪大肠杆菌无抑杀作用，即猪大肠杆菌对其耐药。黄柏、板蓝根、岩坨、马蹄香、灯盏花水煎液抑菌圈内虽然革兰氏染色为无菌，但抑菌圈直径皆小于10ml，可判定为对猪大肠杆菌耐药。据上结果，选取当归、黄连、黄芩、白头翁进行MIC测定。

3.2 中药水煎液MIC实验结果

表2 各中药水煎剂对猪大肠杆菌M IC测定结果Table1 Determination result of Escherichia coli MIC in Escherichia coli by Decoction of various Chinese herbal medicines

由表2可知，黄连水煎剂对大肠杆菌抑菌效果最显著，其MIC为62.5mg/ml，其次为黄芩和白头翁，分别为125mg/ml和250mg/ml，当归的抑菌效果最不明显，为500mg/ml，该结果与抑菌圈测定结果不一致。

4 讨论

4.1 本实验所用10种中药材皆为实地购买，这就避免了因在中药市场所购药材导致的质量瑕疵及产地有误等因素。所选10种中药材皆为云南省主产药材，其中黄芩、黄连、白头翁在临床上已被广泛应用于抗菌药或抗菌饲料添加剂，尤其是黄芩近年来被广泛用作饲料添加剂用于防治细菌性疾病，且已有大量报道黄芩临床抗菌效果切实有效[7]。

4.2 中药水煎剂为我国最传统，使用最广泛，且最早的药物剂型，因其制备简单、奏效迅速，尤其适应于中医辨证治疗原则，能够根据患畜临床需要配伍药方或加减药量，进而起到增强药效的作用，为我国中兽医宝贵的经验财富。但是传统的煎煮方法，没有统一的质量标准，而且中药煎煮涉及到药材的浸泡、加水量、火候控制、煎煮时间、煎煮容器等因素的影响，操作虽然简单，在实际应用过程中常出现水煎剂溶解不充分、药效不稳定等缺点[8]。

4.3 用牛津杯法测定中药水煎剂对猪大肠杆菌的抑菌圈，水煎剂为生药浓度1g/ml时，当归水煎剂的抑菌圈可达到17mm，说明该浓度下当归水煎液对猪大肠杆菌体外有很强的抑杀作用，其对大肠杆菌的抑菌效果显著高于黄芩、黄连、白头翁及其他中草药水煎剂。而测定当归水煎液对猪大肠杆菌MIC却显示3个实验重复结果皆为500mg/ml，其对大肠杆菌的抑杀效果低于黄芩和黄连水煎液，该结果与牛津杯法测定抑菌圈的结果不一致。可能因为各中药水煎液在平板上的扩散能力强弱不同，当归水煎液在平板上扩散能力较强，且在其扩散范围内能抑制细菌的生长，所以可形成较大的抑菌圈，且圈内革兰氏染色显示无菌。虽然黄芩、黄连的水煎液对猪大肠杆菌的抑杀作用可能高于当归水煎液，但其在平板上的扩散能力低于当归水煎液，所以其形成的抑菌圈小于当归水煎液。该实验结果提示，不能仅以单一的牛津杯法、打孔法在平板上形成的抑菌圈大小来直接判定某种中药材水煎液或其他有效成分的体外抑菌效果，还需结合其他方法加以判定。

4.4 本试验所选的10种中草药除马蹄香、茯苓和板蓝根3中草药水煎液对大肠杆菌体外抑菌效果不理想外，其他7种中草药水煎剂对猪大肠杆菌都有不同程度的抑制作用，尤其是黄连、黄芩、当归和白头翁对猪源大肠杆菌有较强的体外的抑菌作用。该结果对临床应用中草药防治猪大肠杆菌病及筛选效果良好的抑菌中草药物进行抗菌兽药研发有一定的指导意义。但本实验所用水煎液都经过高压灭菌，高温可能对中药有效成分有较大影响，且中草药成分复杂[9]，抗菌机制尚不清楚，抑菌有效成分复杂，而且中草药受体外与体内环境的影响较大，中药体内抑菌作用也可能是通过提高机体免疫力达到抑菌目的，而不是直接的抑杀作用，因此选择中草药进行兽药研发时不能单单依据体外抑菌实验结果进行筛选[10]。

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[7]施高翔，邵菁.黄芩及其有效成分抗菌作用新进展.[J].中国中药杂志.2014,10(19):3713-3719.

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[9]李淑梅，杨帆.中草药提取物对大肠杆菌的体外抑菌试验.[J].安徽农业科学.2006,34(23):6212-6222.

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S853.71

B

1003-8655（2017）04-0013-03

云南省重点新产品开发专项《云南地区主产中药材猪用中兽药饲料添加剂研发及应用》(2016BC014)；

刘永波(1989-)，河南人，男，在读硕士研究生，研究方向为动物疫病防控及中药免疫学，757259269@qq.com.

宋春莲(1972-)，云南晋宁人，女，讲师，博士，研究方向为动物组织胚胎学及疫病防控技术，Tel:13888001944，E-mai1:466569879@qq.com.