高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用

汤俊明， 刘奇， 王学才， 乔国洪

临床与基础研究

高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用

汤俊明， 刘奇， 王学才， 乔国洪

目的建立高分辨率熔解曲线分析技术 (high resolution melting，HRM)检测BRAF基因V600E突变的方法，并探讨其在临床检测中的应用价值。方法用所建方法检测16例甲状腺乳头状癌患者超声引导下细针穿刺抽吸活检标本，并与测序法结果进行比较分析。结果所建HRM检测方法Ct值与Tm的CV值均较小，重复性好。HRM法BRAF基因V600E突变检测标本的结果与测序法相比较，突变检出率分别为43.75%和40.00%，敏感性为100.00%，特异性为90.00%。结论成功建立的HRM法检测BRAF基因V600E突变敏感性高，特异性强，重复性好，操作简便，节约时间，成本低，适合细针穿刺抽吸活检标本检测BRAF基因V600E突变。

BRAF基因V600E； 癌, 乳头状 ； 甲状腺乳头状癌； 高分辨率熔解曲线分析技术

甲状腺乳头状癌(thyroidpapillary carcinoma，PTC)是甲状腺癌中最常见的类型，占60%～80%[1]。有学者发现，甲状腺癌发病率增加的原因主要归因于PTC 发病率的增加[2]。近年来，越来越多的学者深入研究PTC 分子机制认为，BRAF V600E 基因检测联合细针穿刺细胞学检查(fineneedle aspiration cytology，FNAC)不仅能有效鉴别甲状腺结节的良、恶性，而且对PTC 的诊断与预后具有较高的价值[3-5]。近年来兴起的高分辨率熔解曲线分析技术 (high resolution melting，HRM)是在实时荧光定量PCR 基础上通过饱和荧光染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的分子诊断技术[6]。我们采用HRM技术建立BRAF基因V600E突变的检测方法，并用于检测临床标本，探讨其应用价值。

1 资料和方法

1.1 标本

2016年10月至2017年3月，宜兴市人民医院超声引导下细针穿刺抽吸活检标本并经病理确诊PTC 16例，其中男7例，女9例，平均年龄57岁。穿刺标本离心去上清，待用。用DNA FFPE 试剂盒 (德国Qiagen公司)提取离心后的穿刺标本组织DNA，并保存于-20 °C备用。

1.2 实验方法

1.2.1 引物 设计适用于HRM技术检测BRAF基因V600E突变的引物，引物序列如下：正向引物：5′-CTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3′，反向引物：5′-AGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGT-3′。

1.2.2 HRM反应体系与反应条件 HRM技术检测BRAF基因V600E突变反应体系为：DNA模板，Light Cycler HRM Master Reaction Mix (瑞士Roche公司), 200 nM primers和3 mM MgCl2，总反应体积20 μl。采用仪器为Roche Light Cycler 480 system。HRM技术检测BRAF基因V600E突变扩增反应条件为：先95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共45个循环(采用touchdown技术，前10个循环退火温度从65 ℃降至55 ℃，每个循环降1 ℃)。扩增结束直接进行HRM分析，反应条件为95 ℃1 min，40 ℃1 min，熔解曲线数据收集从70 ℃到95 ℃，温度上升速率为1 ℃/s。40 ℃冷却。

1.2.3 检测结果对比分析 HRM技术检测BRAF基因V600E突变结果均与Sanger测序法检测结果进行对比分析。分析其敏感性和特异性。

1.2.4 HRM检测体系的重复性 选取经Sanger测序法验证的突变型和野生型标本各1份，进行HRM检测。每份突变型和野生型标本各重复检测3次，计算不同基因型标本的Tm 与Ct值的CV值。

2 结果

2.1 HRM法和Sanger测序法检测BRAF基因V600E突变

Sanger测序法检测PTC标本16例，其中1例标本因提取的DNA质量差而无法进行检测，实际检测15例，检出BRAF基因V600E突变6例，检出率40.00%。HRM法检测PTC标本16例，检出BRAF基因V600E突变7例，检出率43.75%。测序法无法进行检测的标本，HRM法可以进行检测。HRM法突变检出率略高于测序法。图1和图2为实验中选取的HRM法与Sanger测序法检测BRAF基因V600E突变示意图。

图1 HRM法检测BRAF基因V600E突变示意图

图2 Sanger测序法检测BRAF基因V600E突变示意图

2.2 HRM法特异性和敏感性

HRM法检测BRAF基因V600E突变与测序法相比，特异性为90%，敏感性为100%。其特异性和敏感性符合临床检测的要求。

2.3 重复性评价

野生型和突变型标本经HRM方法检测后，其Tm 的CV值分别为0.03%和0.02%。Ct值的CV值分别为1.72%和1.46%，CV值均较小，可见HRM法检测BRAF基因V600E突变稳定性和重复性好。

3 讨论

BRAF是重要的原癌基因之一。近年来，随着有关PTC分子机制的研究深入，越来越多的研究表明，BRAF基因属于RAF基因家族，其编码的蛋白在RAS—RAF—MEK—ERK信号传导调节途径中起重要作用[7-8]。BRAF V600E 基因突变是PTC 形成与发展的重要分子改变。BRAF V600E 基因检测联合FNAC，不仅能有效鉴别甲状腺结节的良、恶性，而且对PTC的诊断与预后具有较高的价值[5]。

目前临床上进行BRAF基因V600E突变检测多采用Sanger测序法、免疫组化法和ARMS法。作为金标准的测序法，其操作过程较繁琐、耗时长、对操作技术要求较高。由于测序法本身的方法学限制，其检测灵敏度有限，无法检测DNA含量太低、基因突变比例太低的肿瘤样本。免疫组化法同样操作过程较繁琐、耗时长,对标本和操作技术要求较高。ARMS法操作简便、灵敏，检测周期短，但价格昂贵。因此，研究HRM技术检测BRAF基因V600E突变很有必要。

HRM法的原理是在扩增含突变位点基因的过程中,由于突变位点不匹配会导致双链 DNA在升温过程中先解开,荧光染料从局部解链的 DNA分子上释放, 从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在突变位点[9]。此法操作简便，理论上灵敏度优于Sanger测序法和免疫组化法，和ARMS法相当，但价格低于ARMS法。

本研究中，HRM法检测BRAF基因V600E突变检出率达到43.75%，与其他学者报道一致[8, 10]。其中1例因提取的DNA质量差而无法用Sanger测序法进行检测的标本，运用HRM法却可以顺利检测，并且突变检出率更高，初步显示出HRM法的优势。实际临床检测工作中，对于细针穿刺抽吸活检标本造成DNA质量不高的标本，HRM法检测BRAF基因V600E突变要优于Sanger测序法和免疫组化法，同时相比ARMS法降低了成本。本研究因为样本量小，HRM法的检测灵敏度优势并不明显，后续研究将加大样本量。

综上所述，HRM法具有敏感性高、特异性强、重复性好、操作简便、节约时间及成本低的特点，适合细针穿刺抽吸活检标本检测BRAF基因V600E突变。

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EstablishmentandprimaryclinicalapplicationofdetectingBRAFV600EmutationsbyHRManalysis

TANGJunming,LIUQi,WANGXuecai,QIAOGuohong.

(ClinicalLaboratory,YixingPeople’sHospital,Yixing214200,China)

QIAOGuohong,Email:staff1000@yxph.com

ObjectiveTo establish a method for detecting BRAF V600E mutations by high resolution melting (HRM) analysis and to evaluate its clinical application value.MethodsUltrasound guided fine-needle aspiration biopsy tissues of 16 patients with papillary thyroid carcinoma were detected by HRM. The results of HRM were compared with direct sequencing method.ResultsAccording to the repeatability analysis, the value of coefficient of variance (CV) of Tm and Ct was very small which with good repeatability. The total BRAF V600E mutation rate was 40.00% detected by direct sequencing and 43.75% detected by HRM. The sensitivity of HRM assay was 100.00%, the specificity of HRM assay was 90.00%.ConclusionsThe method for detection of BRAF V600E mutations by HRM analysis was established successfully. It is appropriate for detecting BRAF V600E mutations by HRM analysis. It possesses high specificity, good sensitivity, strong reproducibility, simple operation, saving time and low cost quality.

BRAF V600E; Carcinoma, papillary; Papillary thyroid carcinoma; High resolution melting analysis

无锡市卫计委面上项目(No.MS201536)

214200 江苏 宜兴，宜兴市人民医院 检验科

乔国洪，Email：staff1000@yxph.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.04.010

1674-4136(2017)04-0243-03

2017-03-31] [本文编辑：钦嫣]