全氟辛烷磺酸与载脂蛋白AⅠ非共价键复合物的质谱分析实验探究

谢 东，刘 林，王 献

(中南民族大学 化学与材料科学学院，湖北 武汉 430074)

分析与测试

全氟辛烷磺酸与载脂蛋白AⅠ非共价键复合物的质谱分析实验探究

谢 东，刘 林，王 献*

(中南民族大学 化学与材料科学学院，湖北 武汉 430074)

本文采用电喷雾质谱(ESI-MS)方法，分析研究了载脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)、全氟辛烷磺酸(PFOS)与Apo AⅠ结合的最佳实验条件和仪器参数。探讨了电喷雾离子源温度和碎裂电压对Apo AⅠ蛋白质多电荷质谱峰信号的影响，以及在最佳仪器条件下(电喷雾离子源温度为200 ℃，碎裂电压为175 V)，获得了PFOS-Apo AⅠ形成的蛋白质复合物质谱谱图。在该条件下，Apo AⅠ最多能与PFOS形成化学计量比为1：4的蛋白质复合物。

电喷雾质谱；载脂蛋白AⅠ；全氟辛烷磺酸；蛋白质复合物

全氟化合物由于具有良好的热稳定性、化学稳定性，被广泛应用于工业生产和生活的各个方面，其存在于半导体的制造及厨具涂料、纺织品等表面活性剂、表面保护剂中[1-2]。但近几年研究报道称，以全氟辛酸和全氟辛烷磺酸及其盐类为代表的全氟化合物具有持久性、高度生物累积性、生物体多脏器等毒性[3-4]。在中国各地区的人血浆检测中，沈阳地区PFOS的含量最高，达到79.2 ng/mL，天津地区的含量最低为3.72 ng/mL[5]。Dallaire等人[6]发现这些多卤化物会改变甲状腺素水平。Nelson等人[7]报道全氟化物会扰乱脂质和体重的调节，使低密度脂蛋白含量增高，同时PFOS的暴露会导致总胆固醇含量高达13.4 mg/dL。

载脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分[8]。在生命体的生理作用中，Apo A I不仅能识别和稳定HDL受体蛋白，并且在调节脂质代谢的相关酶的活性上，发挥着极其重要的作用[9-10]。虽然研究表明，全氟类化合物能与脂肪酸运载蛋白结合[11]，但有关全氟类化合物与载脂蛋白的相互作用的质谱研究还鲜有报道。本文采用电喷雾质谱(ESI-MS)软电离技术检测了PFOS与Apo AⅠ形成的非共价键复合物，探索了检测PFOS-Apo AⅠ蛋白质复合物的最佳实验条件。通过优化ESI离子源的仪器参数，尽可能地保持蛋白质与配体分子的弱相互作用，同时获得最佳的质谱信号强度，是实验成功的关键。

1 实验

1.1 试剂与仪器

载脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ，85%，美国Sigma公司)；乙酸铵(99.0%，阿拉丁公司)；冰醋酸(分析纯，国药化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Waltman公司)；全氟辛烷磺酸(200 μmol·L-1，美国Sigma公司)。

6520 ESI Q-TOF-MS液相色谱-质谱分析仪(美国Agilent公司)；GL-20高速冷冻离心机(上海卢湘仪器离心机有限公司)；Milli-Q Advantage A10数位超纯水系统Type Ι(美国Millipore公司)；FE20实验室pH计(梅勒特-托利多仪器上海有限公司)；KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂); FA1004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2 溶液配制

配制pH值6.9醋酸铵缓冲溶液溶解 Apo AⅠ样品至所需浓度，和蛋白质与PFOS的浓度比为1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8的一系列待测溶液，每一浓度下平行重复3次，最终蛋白质浓度为2.5 μmol·L-1。将配制好的混合溶液均放置在37 ℃的恒温水浴锅中恒温孵育30min，然后进行ESI-MS的检测。

1.3 仪器条件

型号6520的ESI-Q-TOF MS仪器模式采用正离子模式进行检测，样品以标准进样方式采取自动进样。液相色谱的流动相为超纯水，仪器采集范围600～3800 m/z。在一定的干燥气温度、碎裂电压，设置干燥气流速为8 L·min-1，喷雾器压力65 psig，毛细管电压3500 V。

2 结果与讨论

2.1 Apo AⅠ蛋白的ESI-MS实验条件摸索研究

2.1.1 电喷雾离子源温度的影响

图1 不同离子源温度下的Apo AⅠ的ESI-MS质谱图

在保持其他条件不变的情况下，ESI-MS检测了不同的离子源温度对Apo AⅠ蛋白质的多电荷离子分布图谱，如图1所示，分别对应离子源温度为200，250，275，300℃的质谱谱图。Apo AⅠ信号较强的离子峰多电荷分布区域主要包括+11至+15，和+21至+35。高质荷比区的离子峰，蛋白质所带电荷数较少，即反映了天然状态下结构较紧致的蛋白质构象，而蛋白质去折叠后所带电荷数增加，主要形成低质荷比分布的离子峰。当离子源温度升高至275℃时，电荷分布为+11至+15的离子峰信号强度较250℃时低，因此250℃比275℃的条件下更能反映蛋白的自然状态。当温度升高至300℃时，仅存在部分自然态状态下的多电荷峰，并且整体向低质荷比区偏移，表明绝大多数蛋白质已经解离。因此，在温和的温度下更利于检测未解离状态下的蛋白质。但在200℃的温度下质谱检测到的多电荷峰强度反而较低，可能由于温度较低影响去溶剂化效果，造成样品的离子化效率降低，灵敏度下降。

2.1.2 电喷雾碎裂电压的影响

图2 不同碎裂电压下的Apo AⅠ蛋白的ESI-MS谱图

电喷雾质谱的碎裂电压是影响蛋白质和蛋白质复合物多电荷分布的另一关键因素。改变碎裂电压分别为175、200、250 V，如图2可见，当裂解电压逐渐增加，电荷分布为+11至+15的自然态下蛋白质多电荷峰的信号强度和个数都有明显降低。这是由于温和的碎裂电压更利于检测未解离状态下的蛋白质多电荷峰。综合多电荷峰个数及信噪比可知，在碎裂电压为175 V时，为蛋白质检测的最优条件。

2.2 PFOS与Apo AⅠ蛋白复合物的ESI-MS检测

上述Apo AⅠ空白蛋白质谱条件的优化，为PFOS与Apo AⅠ复合物的检测提供了参考。在其他条件不变的情况下，选取在不同离子源温度及碎裂电压下进行检测PFOS-Apo AⅠ的复合物峰(离子源温度和碎裂电压分别为：200℃、225℃、250℃；175V、200V、250 V)。当离子源温度为200 ℃时， Apo AⅠ能与4个PFOS结合形成蛋白质复合物。随着温度的增高，配体结合数目及复合物峰强度均有降低，这是由于较高温度导致蛋白质构象的改变，从而不利于与配体形成稳定的复合物峰。同时，考察了碎裂电压的影响，在175 V时的质谱信号最强，是由于在较温和的碎裂电压下更利于检测蛋白质复合峰。对比复合物的结合峰强度及结合配体的个数可知，200 ℃、175 V更适合检测PFOS-Apo AⅠ非共价键复合物，见图3。

A)干燥气温度200 ℃；B)碎裂电压175 V； C) 干燥气温度225 ℃；D) 碎裂电压200 V；E)干燥气温度250 ℃；F)碎裂电压250 V

图3 Apo AⅠ与PFOS配体分子的ESI-MS谱图

Fig.3 ESI-MS spectra under optimal conditions for the solution of Apo AⅠand PFOS at 1:4 molar concentration ratio

3 结论

由于分析检测非共价键蛋白质复合物，需要尽可能地保持蛋白质与配体的弱相互作用，又要保证较高的灵敏度以获得最强的质谱信号，因此实验条件的探索对PFOS-Apo AⅠ的检测十分关键。本文分别探索了自然态的Apo AⅠ蛋白质，以及PFOS-Apo AⅠ复合物质谱检测的最佳条件。PFOS-Apo AⅠ复合物ESI-MS检测的最佳条件为：离子源温度200 ℃，碎裂电压175 V，进样体积为5 μL。Apo AⅠ最多能结合4个PFOS配体分子，分别形成化学计量比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的蛋白质复合物。

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(本文文献格式：谢 东，刘 林，王 献.全氟辛烷磺酸与载脂蛋白AⅠ非共价键复合物的质谱分析实验探究[J].山东化工,2017,46(11):88-90.)

Mass Spectrometric Analysis of Noncovalent Protein Complex of Perfluorooctane Sulfonic Acid and Apolipoprotein AⅠ

XieDong,LiuLin,WangXian*

(College of Chemistry and Material Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074，China)

In this work,we have analyzed apolipoprotein AⅠ (Apo AⅠ),and the protein complex of Apo AⅠcombined with perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) by electrospray mass spectrometry (ESI-MS),The key parameters of ESI-MS and experiment conditions have been optimized. The effects of source temperature and fragmentor voltage on Apo AⅠESI-MS spectra have been explored. Under the optimal experiment conditions (i.e. electrospray ion source temperature at 200 ℃,fragmentor voltage at 175 V),we have detected the s
Table protein complex of PFOS and Apo AⅠ. Results showed that at this conditions,Apo AⅠcan combined with PFOS at an maximal stoichiometric ratio of 1∶4.

electrospray mass spetrometry; apolipoprotein AⅠ;perfluorooctane sulfonic acid;protein complex

2017-04-14

国家自然科学基金项目(21675176，21275167)；湖北省自然科学基金项目(2014CFA025)

谢 东(1992—)，女，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向为分析化学；王 献(1978-)，女，湖北武汉人，博士，教授，主要从事质谱分析研究。

TQ028;O657.63

A

1008-021X(2017)11-0088-03