转录因子SOX2抑制肺癌细胞系顺铂药物敏感性的作用研究

王 婧，张 淼，贺海燕，杨佳丽,2，石 娟,2,朴文花,3

·论 著·

转录因子SOX2抑制肺癌细胞系顺铂药物敏感性的作用研究

王 婧1，张 淼1，贺海燕1，杨佳丽1,2，石 娟1,2,朴文花1,3

目的研究Wnt/β-catenin信号与SOX2相互作用对肺癌细胞系顺铂药物敏感性的影响。方法分别以顺铂药物敏感和耐药的细胞系A549和A549/DDP为模型，转染SOX2过表达或shSOX2质粒，采用免疫印迹法对Wnt/β-catenin信号中相关蛋白表达情况进行检测分析，运用流式细胞仪对SOX2抑制顺铂诱导的肺癌细胞凋亡进行观察。结果SOX2过表达组中，Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白active-β-catenin、靶基因Cyclin D1的表达均下降，但GSK-3的表达量明显增高，而shSOX2处理组中，ABC、Cyclin D1的表达均升高；过表达SOX2可以极显著性地抑制顺铂诱导的凋亡，反之，shSOX2瞬时表达极显著地增加顺铂诱导的凋亡。结论SOX2可抑制肺癌细胞中Wnt/β-catenin信号的活性，在肺癌顺铂药物耐药性中发挥重要的作用，可能作为肺癌耐药性治疗的一个新靶标。

肺癌；SOX2；Wnt/β-catenin；耐药；顺铂；凋亡

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率在近几年仍不断攀升[1]。在过去10年间，尽管肺癌的治疗从手术切除到放化疗及靶向治疗都有很大提高，但肺癌患者5年存活率仅为17%[2]，其中肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性是降低存活率的主要原因，约90%的患者会发展为肺癌一线化疗药物顺铂的耐药[3]。因此，进一步了解导致肺癌复发和耐药的分子机制对提高患者的生存率有重要意义。本研究针对Wnt/β-catenin信号和SOX2、shSOX2相互作用对肺癌细胞系顺铂敏感性作用机制进行分析，旨在揭示其在肺癌细胞中对顺铂耐药的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系和抗体:人肺腺癌A549细胞系(Cat，CCL-185)购自ATCC细胞库，人肺腺癌顺铂药物耐药A549/DDP细胞系购自中科院北京细胞库，所用抗体见表1。

表1 实验中所用抗体信息情况

1.2 药物与试剂:顺铂药物(Cayman chemical company)；1640培养基(Gibico)；胎牛血清(BI公司)；所用全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(全式金生物公司)；凋亡检测试剂盒(BD公司)；Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 质粒构建

1.3.1.1 SOX2质粒构建:为了产生能够在哺乳动物细胞中过表达性别决定区Y-box基因2(SOX2)的质粒，将人SOX2 cDNA(NM_003106)克隆到CMV启动子(Invitrogen，USA)下游的pcDNA3.1骨架质粒中，称为pCDNA-SOX2。

1.3.1.2 shSOX2质粒构建:shSOX2即为抑制SOX2表达的质粒构建，通过使有义寡核苷酸5'-CCGGCGCTCATGAAGAAGGATAACTCGAG TTATCCTTCTTCATGAGCG TTTTTG-3'和反义寡核苷酸5'AATTCAAAAACGCTCATGAAGAAGGATAACTCGA

GTTATCCTTCTTCATGAGCG-3'退火而产生小发夹RNA(shRNA)，将得到的双链shRNA克隆到GV248载体(GenePharma，上海)中。

1.3.2 A549、A549/DDP细胞培养、转染和顺铂刺激:将A549和A549/DDP细胞系培养在加有10%胎牛血清的1640培养基中，放置于37 ℃、95%湿度及5%的二氧化碳的培养箱中培养。待A549和A549/DDP细胞系长到70%～80%时，利用Lipofectamine LTX将SOX2或shSOX2质粒转染到A549和A549/DDP细胞中，转染24 h后，加入浓度为5M顺铂药物刺激24 h后，收集细胞，用于后续流式细胞检测和Western-blot分析。

1.3.3 流式细胞检测:按照凋亡检测试剂说明书要求将各处理组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗2遍，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的细胞悬液，各处理组取出100 μl细胞悬液体，进行Annexin V和碘化丙啶(PI)染色，室温(20～25 ℃)避光处放置15 min，使用流式细胞仪(BD FACSCalibur Ⅱ)上机检测，用Cell Quest software软件进行分析。

1.3.4 蛋白免疫印迹实验:将提取的细胞总蛋白、胞浆蛋白及细胞核蛋白在测定总蛋白浓度后，调整蛋白浓度，使每孔上样量为50 g，然后进行10%SDS PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭1h；加入合适稀释后特异一抗，4 ℃过夜孵育，次日平衡到室温后PBST漂洗3次×10 min后，加辣根过氧化物酶(POD)标记的相应二抗，室温孵育1.5～2 h；漂洗后用ECL底物显色，X线片曝光显影，测定目的蛋白条带灰度值。实验组与对照组灰度值相比，得到相对表达量，以此来分析目的蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 SOX2抑制肺癌细胞中的Wnt/β-catenin信号活性:以顺铂药物敏感和耐药的细胞系A549和A549/DDP为模型，转染SOX2过表达或shSOX2质粒，采用免疫印迹方法对Wnt/β-catenin信号中关键蛋白表达的情况进行检测分析。结果表明，与对照组相比，SOX2过表达组中，Wnt/-catenin信号通路的关键蛋白Active-β-catenin(ABC)、靶基因Cyclin D1的表达均下降，但GSK3的表达量明显增高。反之，shSOX2处理组中，ABC、Cyclin D1的表达均升高，结果表明SOX2可能抑制肺癌细胞中Wnt/-catenin信号的活性，见表2。

表2 SOX2抑制A549和A549/DDP细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的结果

注:A组为全蛋白，B组为核蛋白。

2.2 SOX2减少顺铂药物诱导的肺癌细胞凋亡:为了探讨SOX2对顺铂介导的肺癌细胞凋亡的影响，运用流式细胞仪检测结果表明，在A549和A549/DDP细胞系中，过表达SOX2可以极显著性地抑制顺铂诱导的凋亡，反之，shSOX2瞬时表达极显著地增加顺铂诱导的凋亡；A549细胞处理组中，Control(4.52±0.78)%，SOX2(16.70±2.54)%，shSOX2(25.82±4.07)%；A549/DDP细胞处理组中，Control(3.62±3.41)%，SOX2(2.44±1.94)%，shSOX2(7.46±3.82)%，但是凋亡细胞的总数较小。结果显示，SOX2可能是用于顺铂耐药型肺癌细胞化疗的一个靶标。

通过免疫印迹法对SOX2抑制顺铂药物诱导的肺癌细胞凋亡信号通路的关键蛋白进行验证，结果显示，在A549肺癌细胞系中，无顺铂药物的存在时，过表达SOX2可以增加凋亡前提蛋白Caspase3的表达，抑制AIF的表达。在顺铂药物耐药的细胞系A549/DDP中，过表达SOX2可以降低Caspase3的表达；反之，在A549细胞系中，当顺铂药物存在时，过表达SOX2或者shSOX2干扰会降低Caspase3的表达而增加AIF的表达。但是在A549/DDP中，过表达SOX2可以显著增加Caspase3的表达而降低AIF的表达。

3 讨论

化疗是目前公认的治疗肺癌的方法之一，其中顺铂药物是临床用于晚期肺癌治疗的一线药物[4]，然而化疗药物耐药性的发展是最终导致肺癌化疗失败的主要原因。因此，通过对肺癌耐药机制的深入研究，为癌症耐药治疗发现新的靶标成为可能。

Wnt/β-catenin信号已被确认在多种癌症的发生发展中起着关键性的作用，其在50%肺癌切除样品中被检测出异常的高表达，与肺癌细胞的增殖和转移密切相关[5]。大量研究表明，Wnt/β-catenin信号在癌症干细胞(CSC)命运决定中也起着关键的角色，且肿瘤干细胞对化疗或靶向治疗药物具有抵抗作用[6]。Wnt信号通路在细胞增殖、迁移、器官形成及组织稳态等过程中发挥着重要的作用[7]。最近越来越多的证据表明，SOX2和Wnt信号传导途径之间相互关联[8]。本实验结果发现，在A549细胞和A549/DDP细胞中SOX2通过调节GSK3的表达抑制Wnt/β-catenin信号通路。同时有研究发现，SOX2可协同β-catenin作用转录调节CCND1(细胞周期蛋白D1)基因的表达，并通过促进乳腺癌细胞在G1/S期的转变促进细胞增殖和肿瘤发生[9]。这些研究和本结果一致，意味着SOX2调节Wnt/β-catenin信号通路活性的双重功能与细胞的种类相关。

SOX家族成员在肺脏发育以及肺肿瘤的发生发展中起着重要的作用。由于SOX2在胚胎发育以及包括肺癌在内的许多癌症的发生中起着关键性的作用，因此SOX2是目前研究最广泛的一个基因[10]。SOX2参与许多癌症发生的过程，例如细胞增殖，通过与其他致癌、发育途径相互作用规避细胞凋亡和转移[11]。此外，越来越多的证据表明，SOX2的基因在常规肺癌化疗治疗中具有重要影响[12]，且其在肺癌的发病和耐药机理中MAP4K4、EGFR、Src/Akt和BMP4信号通路密切关联。本实验结果发现抑制SOX2的表达可能提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。有相关研究与本实验结果一致，表明SOX2可以通过调控Wnt/β-catenin信号途径在乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌和骨肉瘤癌变中发挥重要作用。同样值得注意的是，SOX2的敲除可诱导非小细胞肺癌细胞凋亡[13]，例如，shRNA介导SOX2在EGFR突变的肺癌HCC827细胞表现出降低细胞增殖，并对埃洛替尼的敏感性增加。因此，SOX2的基因在肺癌靶向治疗中具有一定的意义。

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TranscriptionfactorSOX2inhibitthesensitivityofcisplatininthelungcancercellline

WANGJing1,ZHANGMiao1,HEHaiyan1,YANGJiali1,2,SHIJuan1,2,PIAOWenhua1,3

1.DepartmentofClinicalPathology,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China；2.GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；3.TheFirstAffiliatedHospitalofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China

Correspondingauthor:PIAOWenhua,Email:wenhuapiao@163.com

ObjectiveTo explore the interaction of Wnt/-catenin signal pathway and the transcription factor SOX2 to the sensitive of cisplatin in the lung cancer cells.MethodsA549 cells ware used as cisplatin sensitive model and A549/DDP cells as cisplatin resistant model.Over-expression SOX2 and shSOX2 plasmid were transfected respectively.The key proteins of Wnt/β-catenin signaling pathway were measured by western-blot; the apoptosis rate of lung cancer cell induced by cisplatin was detected by the flow cytometry.ResultsCompare to the control group,the expression rates of active-β-catenin and the target gene Cyclin D1 were decreased in the SOX2 group; while,the expression of ABC and Cyclin D1 were increased in the shSOX2 group.Compare to control group,over-expression of SOX2 group significantly suppressed the apoptosis induced by cisplatin,instantaneously,shSOX2 significantly increased the apoptosis induced by cisplatin.ConclusionThis results suggest that SOX2 may inhibit the activity of Wnt/β-catenin signal in the lung cancer cells.SOX2 may be an important regulator in development of chemoresistance,which may imply that SOX2 may be a novel therapeutic target for treatment chemoresistant lung cancer.

Lungcancer;SOX2;Wnt-β-catenin;Chemoresistance;Cisplatin;Apoptosis

宁夏自然科学基金项目(NZ14166)

1.宁夏人民医院临床医学检验诊断中心，宁夏 银川 750002 2.宁夏医科大学总医院，宁夏 银川 750004 3.西北民族大学第一临床学院，宁夏 银川 750002

王婧(1986-)，女，硕士学位，主管技师，从事分子生物学研究方向。

朴文花，Email:wenhuapiao@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170814.1453.006.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0676

R735

A

2017-02-03 [责任编辑]李 洁