弥漫大B细胞淋巴瘤中BCL-2等蛋白表达与临床预后的相关性研究

张 淼，贺海燕，李 晶，王 平，王 婧，吴 涛，金哲宇，2，朴文花，3

·论 著·

弥漫大B细胞淋巴瘤中BCL-2等蛋白表达与临床预后的相关性研究

张 淼1，贺海燕1，李 晶1，王 平1，王 婧1，吴 涛1，金哲宇1，2，朴文花1，3

目的探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白表达特点及其与临床预后的关系。方法应用免疫组织化学法技术及荧光原位杂交(FISH)技术，对59例确诊为DLBCL样本进行检测，了解其表达情况，同时探讨与临床预后的相关性。结果发生BCL-2基因易位2例，BCL-6基因重排15例；BCL-2蛋白表达40例(67.8%)，BCL-6蛋白表达36例(61%)，C-myc蛋白表达44例(74.6%)，FOXP1蛋白表达26例(44.1%)，CD44V6蛋白表达21例(35.6%)。单因素、多因素相关分析显示，BCL-6基因易位，BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白表达均对患者的总生存期(OS)有显著影响，是OS独立的预测因素。结论BCL-2蛋白及基因表达提示预后不良；BCL-2、C-myc蛋白共同表达者，预后更差。BCL-6蛋白及基因表达提示预后良好。联合应用生物标记物能在一定程度上反映DLBCL肿瘤的异质性及预后。

弥漫大B细胞淋巴瘤；蛋白标记物；免疫组织化学方法；临床预后

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一型，肿瘤具有高度的异质性，在蛋白表达、形态学表现、治疗反应及预后均存在差异[1]。捕捉反映肿瘤异质性的预测因子，能够更好的帮助临床调整治疗策略和评估预后[2]。本研究选取了5种可能与DLBCL预后相关的蛋白标记物，通过随访分析，了解其表达特征及与临床预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源:所有DLBCL标本均来自于宁夏人民医院，收集2010年1月-2015年10月初次诊断的、临床实验室资料完整的DLBCL病例。按照WHO2016版进行组织学分型，所有患者术前均未接受过治疗。

1.2 临床资料:本组DLBCL患者共59例，其中GCB组20例，non-GCB组39例；男性34例，女性25例；中位年龄54岁(26～81)，≥60岁26例；结内34例(57.6%)，结外25例(42.3%)。同时收集59例患者的常规临床资料及临床分期(AnnArbor分期，胃肠道为Lugano分期)、有无B症状、血清乳酸脱氢酶(LDH)有无升高、结外病种累及数量等，进行IPI评分、ECOG评分。给予患者蒽环类药物为基础的联合化疗，选择CHOP或CHOP样方案，部分患者联合放射治疗或给予利妥昔单抗注射治疗。

1.3 免疫组化法染色:所用一抗抗体(BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6)及SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司，标本均使用Dako全自动免疫组化染色机，采用两步法，进行阴性阳性及空白切片对照，DAB显色。

1.4 免疫组化的结果判读:采用定性判断，肿瘤细胞出现定位清晰的棕褐或棕黄色着色，且>30%肿瘤细胞着色判读为阳性。

1.5 荧光原位杂交(FISH)检测:BCL-6双色断裂分离探针和BCL-2/IGH双色融合易位探针均购自北京金菩嘉医疗科技公司，操作及判读方法参见说明。染色结果见图1-图6(目录后)。

1.6 统计学方法:采用SPSS 18.0统计软件，各组率的比较采用χ2检验，各因素对预后生存时间的影响采用Kaplan-meier检验进行分析。

2 结果

2.1 临床特点：59例患者中出现症状32例，血清LDH升高(>220 U/L)29例，临床分期Ⅲ～Ⅳ期29例，IPI评分≥3分29例，ECOG评分≥2分25例，结外受累病灶≥1灶25例；59例患者均接受以蒽环类为基础的联合化疗。本组随访时间(22.7±11.9)个月，中位总生存期33.367 6个月；随访期间死亡30例，总死亡率50.8%，3年死亡率56.91%，5年生存率69.78%。

2.2 蛋白表达情况：依据Hans分型将患者分为GCB组和Non-GCB组，GCB组随访期间死亡率为64.12%，Non-GCB组随访期间死亡率为25.00%，GCB组死亡率高于Non-GCB组，差异有统计学意义(χ2=8.088，P<0.05)，见表1。

表1 2组患者死亡情况的比较

2.3 BCL-2、BCL-6蛋白及基因表达与预后的相关性:见表2。BCL-2蛋白表达与患者死亡率间差异有统计学意义(χ2=16.882，P<0.05),BCL-2蛋白表达提示预后不良。BCL-2基因表达与患者预后无相关性(P>0.05)，BCL-2蛋白表达与基因表达间无相关性。BCL-6蛋白表达与患者死亡率间差异有统计学意义(P<0.05),BCL-6基因表达与患者预后存在相关性(P<0.05)；BCL-6蛋白及基因表达提示预后较好，BCL-6蛋白与基因表达间存在相关性。

表2 BCL-2、BCL-6蛋白及基因表达死亡情况的比较

2.4 C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白表达与预后的相关性:见表3。单因素相关分析显示，C-myc蛋白表达与患者死亡率间差异有统计学意义(P<0.05),C-myc蛋白表达提示预后不良。FOXP1表达与患者死亡率有相关性(P<0.05)，FOXP1蛋白表达患者死亡率较高。CD44V6蛋白表达与患者死亡率间差异有统计学意义(P<0.05),CD44V6蛋白表达提示患者预后不好，死亡率高。同时IPI评分较高与死亡率有高度相关性(P<0.05)。

表3 BCL-2、BCL-6、C-myc蛋白表达与预后的比较

2.5 BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白对生存时间的影响:将上述单因素参数进一步纳入COX风险比例模型，进行预后多因素分析。按照免疫组化染色结果分为阳性组和阴性组，2组间BCL-2比较差异有统计学意义(P<0.05,χ2=18.603,RR=7.309)；2组间BCL-6比较差异有统计学意义(P<0.05,χ2=17.597,RR=0.233)；2组间C-myc蛋白差异有统计学意义(P<0.05,χ2=16.561,RR=43.567)；2组间FOXP1差异有统计学意义(P<0.05,χ2=39.115,RR=10.815)；2组间CD44V6蛋白差异有统计学意义(P<0.05，χ2=13.912,RR=3.728)。结果显示，BCL-2、C-myc蛋白、FOXP1蛋白、CD44V6蛋白阳性组生存情况均明显不如阴性组，而BCL-6阳性组患者预后较好。

3 讨论

弥漫大DLBCL至今未明确免疫标记物和分子模型，如果能找到更加准确的治疗靶点和预后标记物，势必会提高DLBCL患者的预后和生存质量[3]。

BCL-2基因位于18q21，是抑制细胞凋亡的基因，BCL-2过表达为恶性肿瘤患者生存提供了优势，同时能在化疗耐药中起到关键作用[4]。BCL-2基因融合导致了BCL-2蛋白过表达，扰乱了细胞增殖与凋亡的平衡，与淋巴瘤的发生演变密切相关[5-6]。C-myc基因是位于8q24的原癌基因，C-myc基因异常表达是癌变过程中较早出现的分子改变。在DLBCL中，15%的患者中出现C-myc基因的扩增，这些患者预后较差[7]。本组患者中，BCL-2、C-myc蛋白表达提示为预后不良的因素，BCL-2、C-myc蛋白共同表达者预后更差。本组患者中BCL-6蛋白阳性及基因重排预后较好，基因重排与蛋白表达存在相关性，研究结果与报道一致[8]。

FOXP1蛋白属于FOXP家族，在不同分化阶段的B细胞中均有表达，但不表达浆细胞，是B细胞发育过程的关键转录调节因子[9]。本组病例中，FOXP1蛋白高表达的患者死亡率较高，预后不良，与文献报道一致。FOXP1表达失调可能在DLBCL中起着重要作用，FOXP1高表达是DLBCL预后不良的指标。本组患者中，FOXP1阴性表达预后明显好于阳性表达者，阳性表达率为44.1%，略高于国外文献报道的18%～40%[10]。多因素回归分析显示，FOXP1高表达是DLBCL的独立预后因素。

CD44V6基因定位于人类11号染色体短臂上，它是CD44分子中包含外显子6的拼接异构体。在免疫体统中，CD44被称为“归巢受体”，外周血淋巴细胞利用CD44粘附到毛细血管壁，达到回归淋巴组织的目的。CD44V6参与淋巴细胞活化增殖，与肿瘤发生密切相关[11]。本组患者中，CD44V6在non-GCB组表达高于GCB组，单因素、多因素分析，提示CD44V6表达是预后不良的因素。有报道显示，DLBCL患者外周血中淋巴与单核细胞比例降低(<2.6)，是R-CHOP治疗后预后不良的表现。CD44V6作为“归巢受体”，可以降低non-GCB组外周淋巴细胞增高，从而影响患者预后[12]，在肿瘤转移中起着重要作用。

本研究通过临床随访，统计学单因素、多因素分析显示，BCL-2基因重排提示预后不良，BCL-6基因重排提示预后良好。BCL-2蛋白、C-myc蛋白、FOXP1蛋白、CD44V6蛋白表达均是患者OS的独立预测因子，是反映患者预后不良的指标。以上研究为DLBCL的预后提供了一些有价值的蛋白标记物，希望这些标记物的联合应用能为临床判断DLBCL患者的预后提供帮助。

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ExpressioncharacteristicsofBCL-2,BCL-6,C-myc,FOXP1andCD44v6indiffuselargeBcelllymphomaanditsrelationshipwithclinicalprognosis

ZHANGMiao1,HEHaiyan1,LIJing1,WANGPing1,WANGJing1,WUTao1,JINZheyu1,2,PIAOWenhua1,3

1.DepartmentofAnatomyPathology,NingxiaPeople'sHospital,Yinchuan750002,China；2.MedicalCollegeofSoochowUniversity,Suzhou215123,China；3.DepartmentofClinicalPathology,FirstAffiliateHospitalofMedicalCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China

Correspondingauthor:PIAOWenhua,Email:wenhuapiao@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of BCL-2,BCL-6,C-myc,FOXP1,CD44V6 in diffuse large B cell lymphoma and research the relationship of these protein’s expression with clinical prognosis.MethodsDLBCL samples were detected by immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH) technique.ResultsBCL-2 gene translocation occurred in 2 cases; BCL-6 gene rearrangement in 15 cases.BCL-2 protein expression in 40 cases (67.8%),BCL-6 protein expression in 36 cases (61%),C-myc protein expression in 44 cases (74.6%),FOXP1 protein expression in 26 cases (44.1%),CD44v6 protein expression in 21 cases (35.6%).Univariate correlation analysis showed that BCL-2 gene translocation,BCL-6,C-myc,FOXP1,CD44V6 protein expression were closely correlated with the overall survival of patients (survival overall,OS),they were independent predictors of OS.ConclusionBCL-2 protein and gene expression suggest poor prognosis; BCL-2,C-myc protein co-expression,prognosis is even worse.The expression of C-myc,FOXP1 and CD44v6 are all suggested that the prognosis of the patients are poor.

DiffuselargeBcelllymphoma;Proteinmarker;IHC;Clinicalprognosis

宁夏科技攻关项目(2012ZYS208)；宁夏自然科学基金项目(NZ16184)

1.宁夏人民医院病理科，宁夏 银川 750002 2.苏州大学医学部临床医学系，江苏 苏州 215123 3.西北民族大学第一附属医院，宁夏 银川 750002

张淼(1976-)，女，山东籍，副主任医师，硕士研究生，从事临床病理诊断工作。

朴文花，Email:wenhuapiao@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170814.1453.006.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0673

R735

A

2017-02-14 [责任编辑]王凯荣