雷公藤内酯醇对黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

胡幼芳，雷 亮

(咸宁市第一人民医院药剂科，湖北 咸宁 437000)

雷公藤内酯醇对黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

胡幼芳，雷 亮

(咸宁市第一人民医院药剂科，湖北 咸宁 437000)

目的探讨雷公藤内酯醇(TPL)对体外培养黑色素瘤细胞SK- Mel- 28增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法以0、20、40、80ng/mL的TPL作用于SK- Mel- 28细胞，采用MTT法检测TPL对细胞增殖作用；流式细胞术测定细胞凋亡率；Western blot用于检测细胞凋亡蛋白的表达；Transwell实验用于检测细胞迁移和侵袭。结果随着TPL浓度和作用时间的增加，细胞增殖率逐渐减低(P<0.05)，而细胞凋亡率逐渐增加(P<0.05)。Western blot结果显示不同浓度的TPL作用SK- Mel- 28细胞后，caspase- 3和Bax蛋白表达量显著增加，Bcl- 2蛋白的表达量显著减低。TPL处理后，转至Transwell膜下表面的细胞数明显少于对照组。结论TPL可抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡，调节凋亡蛋白与促凋亡蛋白的表达，从而在黑色素瘤中发挥抗肿瘤作用。

黑色素瘤；雷公藤内酯醇；增殖；凋亡；迁移；侵袭

恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一种恶性程度极高的皮肤肿瘤，具有高侵袭性、高致死率的特点[1]。黑色素瘤的发生机制比较复杂，目前对于黑色素瘤的治疗，最有效的方法便是切除肿瘤组织。然而，因为黑色素瘤恶性程度较高，对于一些已经发生肿瘤转移，以及到达肿瘤晚期而不适合进行手术的患者，目前依然缺乏有效的治疗药物[2]。因此，探寻安全而有效的抗黑色素瘤药物一直备受广大医学专家的关注。

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F)是一种卫矛科雷公藤属植物，其提取物用于治疗某些疾病已有悠久的历史。1972年，美国Kupchan等[3]首先报道，从中国雷公藤中分离出的3个二萜内酯化合物对人离体鼻咽癌细胞和小鼠白血病瘤谱有很高的抗癌活性，引起人们的广泛关注。这种二萜内酯化合物便是雷公藤内酯醇(Triptolide,TPL)[4]。越来越多的抗肿瘤研究发现，TPL可以抑制肿瘤细胞的增殖，同时诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[5- 6]。本研究拟通过体外实验探讨TPL对黑色素瘤细胞SK- Mel- 28的增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用效果，并对其抗黑色素瘤的作用机制进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人黑色素瘤细胞株SK- Mel- 28购自中国科学院上海细胞生物研究所，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中，定期更换培养液，传代，充分扩增细胞。TPL(纯度≥98.0%)购买于上海融禾医药科技发展有限公司，原液(1 mg/mL)用二甲基亚砜(DMSO)进行配置，随后用磷酸缓冲液稀释10倍备用。溴化噻唑基四唑蓝(MTT)购自上海碧云天生物技术研究所。兔抗人Bcl- 2、Bax、caspase- 3以及GAPDH抗体购自北京博奥森有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自上海碧云天生物技术研究所。流式细胞仪(FACScalibur)是美国BD公司的产品。Transwell 小室购自美国BD公司。

1.2 MTT法检测TPL对SK- Mel- 28细胞增殖的影响 将SK- Mel- 28细胞浓度调整为4×103/mL，接种于96孔板，置于37℃和5%CO2的培养箱中培养。24h后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，加入终质量浓度为0、20、40、80ng/mL的TPL，并以PBS作为对照，继续培养24h、48h和72h后，加5 mg/mL MTT 20μL并培养4h，然后去上清并加入DMSO 150μL，振荡充分后，于酶标仪(美国Bio- Tek)测定A570值。细胞增殖率=实验组A570/对照组A570×100%。

1.3 流式细胞术检测TPL对SK- Mel- 28细胞凋亡的影响 取0、20、40、80ng/mL的TPL处理SK- Mel- 28细胞72h，5%胰蛋白酶消化后收集细胞，离心、弃上清，随后加入70%冷乙醇于4℃下培养过夜，取出后用冷的PBS进行洗涤，并离心，然后加入RNase (10μg/mL)，于37℃孵育15min。最后加入终浓度10μg/mL的碘化丙啶(PI)，混匀后避光反应30min。凋亡细胞百分率通过流式细胞仪检测。

1.4 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平 用0、20、40、80ng/mL的TPL分别作用于SK- Mel- 28细胞24h，随后加入RIPA裂解液裂解细胞，总蛋白浓度用BCA法进行测定。取细胞裂解液(50μg)进行十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝胶电泳，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封闭液封闭1h，分别加入caspase- 3抗体(1∶1000)、Bax抗体(1∶300)、Bcl- 2抗体(1∶300)及GAPDH抗体(1∶5000)，孵育过夜。洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3000)孵育90min。最后通过化学发光法显影。

1.5 Transwell检测TPL对SK- Mel- 28细胞迁移和侵袭的影响 首先用胰蛋白酶消化SK- Mel- 28细胞，将Transwell小室(孔径为8.0μm)放入24孔细胞培养板中。对于细胞迁移实验，在上室中加入含5×104个细胞的无血清培养液，而对于细胞侵袭实验，在上室中加入含1×105个细胞的无血清培养液。两种检测，下室都加入500μL含10% FBS的DMEM培养液。培养48h后，取出Transwell小室，用棉签小心拭去滤膜上表面的细胞，并用聚甲醛溶液(4%)固定细胞(室温)，DAPI染色后于荧光显微镜下计数滤膜下的细胞数，随机选取10个于高倍镜下(×100)进行计数。

2 结 果

2.1 SK- Mel- 28细胞增殖力检测 利用MTT检测后得到的OD值计算细胞增殖率。如表1显示，相比对照组(0ng/mL)，20ng/mL、40ng/mL和80ng/mL的TPL作用于SK- Mel- 28细胞24h、48h和72h均可显著抑制细胞的增殖率，且在相同浓度TPL处理的条件下，72h的SK- Mel- 28细胞增殖率相比24h的增殖率显著降低。该结果表明TPL可显著性降低黑素瘤细胞的增殖能力，并呈现浓度效应和时间效应关系。

表1 TPL对SK- Mel- 28细胞增殖的影响

与0ng/mL TPL组比较，*P<0.05，**P<0.01；与20ng/mL TPL组比较，#P<0.05，##P<0.01；与40ng/mL TPL组比较，△P<0.05

2.2 SK- Mel- 28细胞凋亡率检测 采用流式细胞术对不同剂量的TPL作用72h后的SK- Mel- 28细胞进行凋亡率测定。结果显示(表2)，20ng/mL、40ng/mL和80ng/mL的TPL作用于SK- Mel- 28细胞72h后，与对照组比较(1.3±0.2)，凋亡率显著提高，且差异具有统计学意义。

表2 TPL对SK- Mel- 28细胞凋亡的影响

与0ng/mL TPL组比较，*P<0.05，**P<0.01；与20ng/mL TPL组比较，#P<0.05，##P<0.01；与40ng/mL TPL组比较，△P<0.05

2.3 SK- Mel- 28细胞凋亡相关蛋白表达 Western blot结果显示(图1)，20、40、80ng/mL的TPL作用SK- Mel- 28细胞均能检测到活化的caspase- 3蛋白，且表达量随浓度的增加而增加。此外，用20、40和80ng/mL的TPL处理后，SK- Mel- 28细胞中的Bcl- 2蛋白的表达量分别为86.2%±3.5%、66.3%±5.2%和54.4%±2.5%。Bax蛋白的表达量分别为52.3%±2.2%、68.4±5.1%、87.8%±2.6%，与对照组(0ng/mL)相比，均有统计学意义(P均<0.01)。

图1 Western blot检测SK- Mel- 28细胞凋亡相关蛋白的表达水平

2.4 SK- Mel- 28细胞迁移和侵袭能力检测 如图2和图3(封二)所示，Transwell小室实验结果表明，对于Transwell膜下表面的细胞数，经过20、40和80ng/mL的TPL处理48h后，转至膜下表面的细胞数明显少于对照组，且在80ng/mL的TPL处理后的迁移和侵袭细胞的数目最少。

3 讨 论

TPL是雷公藤的主要有效成分之一，具有免疫抑制、抗菌、消炎、抗肿瘤等功效[7]。此外，越来越多的研究发现，TPL与其他化疗药物联合使用能够明显提升对肿瘤细胞的杀伤作用，同时也能抑制肿瘤细胞耐药性的产生[8]。研究证实，TPL可以通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡与降低细胞转移、侵袭能力等多种途径发挥抗癌作用[9]。与以上研究发现相同，本文也发现，20、40和80ng/mL 的TPL对体外培养的黑色素瘤细胞SK- Mel- 28具有明显的抑制增殖，诱导凋亡以及阻碍迁移和侵袭的作用，与此同时，TPL对细胞凋亡相关的蛋白(caspase- 3、Bcl- 2和Bax)的表达水平也有显著的作用效果。

恶性肿瘤主要表现为细胞失去控制而无限制地增长以及凋亡通路受阻导致细胞堆积，肿瘤细胞的无限增殖严重威胁癌症患者的生命健康。因此，肿瘤防治的关键便是抑制细胞增殖和/或促进细胞的凋亡[10]。本研究发现不同浓度的TPL对黑色素瘤细胞的增殖均产生显著的抑制作用，且呈现浓度效应和时间效应，80ng/mL的TPL处理72h对SK- Mel- 28细胞的抑制作用最明显。同时，研究发现不同浓度的TPL能明显促进SK- Mel- 28细胞的凋亡，且80ng/mL的TPL对凋亡的促进作用最明显。本研究与之前的研究TPL对人脉络膜黑色素瘤株OCM- 1的研究发现一致[11]，因此再次证实了TPL对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用。

研究已经证实，细胞凋亡主要通过线粒体途径和死亡受体途径实现，而该途径的最终执行者是caspases家族。在caspases家族中，caspase- 3是caspase级联反应中的终末执行者，其表达活性与细胞凋亡密切相关[12]。因此，本文研究了TPL对SK- Mel- 28细胞caspase- 3表达的影响，结果发现不同浓度的TPL处理后均能检测到caspase- 3的活性亚基，而且随着TPL浓度的增加，caspase- 3的活化逐渐增强，提示caspase- 3可能与TPL诱导黑色素瘤细胞SK- Mel- 28凋亡过程有关。

Bcl- 2蛋白家族是调节细胞程序性死亡的关键元件，该蛋白家族根据其在细胞凋亡中的作用，分为抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，以Bcl- 2和Bax为代表[13]。Bcl- 2是阻遏细胞凋亡的核心分子，Bax是Bcl- 2家族中关键的促凋亡蛋白[14]。研究表明，Bax/Bcl- 2比值与细胞对凋亡信号的反应密切相关[13]。本研究中发现，不同浓度的TPL作用于SK- Mel- 28细胞，可降低Bcl- 2蛋白表达水平，同时提高Bax蛋白的表达水平，提示TPL促进SK- Mel- 28细胞的凋亡可能与调节Bcl- 2和Bax的表达水平有关。

肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤发生转移的重要机制，而黑色素瘤极易早期发生淋巴结及血道转移[15]。因此，本研究还采用Transwell实验研究了TPL对SK- Mel- 28细胞迁移和侵袭的影响。SK- Mel- 28细胞是恶性度较高的黑色素瘤细胞，具有较强的转移能力。研究发现，不同浓度的TPL能够显著抑制SK- Mel- 28细胞的迁移和侵袭，提示TPL可能具有抑制黑色素瘤转移的作用。

总之，本实验结果证实TPL可通过抑制肿瘤细胞增殖、转移，诱导肿瘤细胞凋亡，调节凋亡蛋白与促凋亡蛋白的表达，从而在黑色素瘤中发挥抗肿瘤作用，为进一步开展临床实验提供了理论依据。

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EffectofTriptolideontheProliferation,Apoptosis,MigrationandInvasionofMalignantMelanomaCells

HU You- fang,LEI Liang
(PharmacyDepartment,XianningFirstPeople'sHospital,XianningHubei437000,China)

ObjectiveTo explore the effects of triptolide(TPL) on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of malignant melanoma cells SK- Mel- 28.MethodsSK- Mel- 28 cells were treated with different levels of TPL(0ng/mL,20ng/mL,40ng/mL,and 80ng/mL).Then MTT assay was used for detection of cell proliferation ability.Flow cytometry was performed to analyze the apoptosis rate of SK- Mel- 28 cells.The expression levels of caspase- 3,Bcl- 2 and Bax were measured by western blot.Transwell assay was performed to detect the migration and invasion of SK- Mel- 28 cells.ResultsThe proliferation rate of SK- Mel- 28 cells decreased significantly,while apoptosis rate significantly increased following the rising of dose and affecting time of TPL(P<0.05).Western blot results showed that the expression levels of caspase- 3 and Bax increased,while the expression level of Bcl- 2 decreased with the increase of TPL concentrations.After TPL treatment,the number of migrated and invasive cells decreased significantly.ConclusionTPL could inhibit proliferation,migration and invasion,and induce apoptosis of melanoma cells.Additionally,it could regulate the expression of apoptosis- associated proteins to play anti-tumor effects on melanoma.

Melanoma;Triptolide;Proliferation;Apoptosis;Migration;Invasion

R932

：A

：2095- 4646(2017)04- 0277- 04

10.16751/j.cnki.2095- 4646.2017.04.0277

2017- 06- 20)