广西甘蔗田马唐对莠去津抗性水平检测及机理初探

王彦辉，杨彩英，马永林，黄辉晔，郭成林，覃建林，马跃峰

广西甘蔗田马唐对莠去津抗性水平检测及机理初探

王彦辉1，2，杨彩英1，马永林1，2，黄辉晔1，2，郭成林1，2，覃建林1，2，马跃峰1，2

(1.广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所，广西南宁530007;2.广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁 530007)

【目的】开展广西甘蔗田间杂草马唐(Digitaria sanguinalis)对莠去津的抗药性及抗性机理的研究，为其科学防除和抗性治理提供参考。【方法】采用盆栽试验，利用整株法测定采集于广西蔗区的25个马唐种群对莠去津的抗性水平;采用生理生化和分子生物学等方法分析研究马唐抗莠去津的机理。【结果】供试马唐种群中76%对莠去津产生抗性，其中贵港1号马唐种群相对抗性水平最高，抗性指数为37.2。崇左4号为敏感品系，百色1号和柳州2号种群3 d后GSTs相对活力明显高于敏感种群;对叶绿素上的D-1蛋白的编码基因psbA基因进行测序，发现抗性种群psbA基因均没有发现突变，GSTs的活性增强与马唐对莠去津的抗性相关。【结论】广西甘蔗种植区马唐对莠去津抗性水平为低到中抗水平，GSTs酶活性的增强可能是产生抗性的主要原因之一。

马唐;莠去津;抗性;GSTs;psbA

【研究意义】莠去津(Arazine)为三氮苯类除草剂，其作用机理是通过改变膜蛋白的空间构型，干扰杂草的光合作用，导致杂草死亡，在我国主要用于甜高粱、甘蔗、高粱、玉米等作物田间除草。目前该类除草剂已成为产生抗性最为严重的除草剂之一[1]。马唐(Digitaria sanguinalis)是我国分布广泛的一种的农田杂草，主要危害玉米、豆类、棉花、花生、甘蔗、蔬菜和果树等作物。在广西地区甘蔗田中常年(使用10年以上)使用莠去津进行防除，单一使用该药剂已经造成田间防效下降，因此，研究马唐对莠去津的抗药性机制，对合理防控杂草，延缓具有除草剂的使用年限具有重要意义。【前人研究进展】广西蔗区常用的除草剂使用较为单一，其中芽前除草剂主要为莠去津和乙草胺。除草剂莠去津在甘蔗地使用量大和年限长，对抗药性研究较少。1970年Ryan等首次报道了千里光对光系统Ⅱ(PSⅡ)抑制剂莠去津产生抗药性，目前已经超过了80多种杂草生物型对PSⅡ抑制剂(三唑酮、尿嘧啶和其他三氮苯除草剂)产生抗药性[1-2]。有关研究认为杂草抗PSⅡ抑制剂的机理主要是D-1蛋白psbA基因突变(靶标位点)和代谢能力增强(非靶标位点)[3-5]。大多数杂草对PSⅡ抑制剂的抗性是除草剂靶标位点或者靶标蛋白(D-1蛋白)改变、亲和性下降引起的。Hirschberg和McIntosh首先报道了苋菜对莠去津的抗性机理，发现类囊体膜的D-1蛋白的228位上的一个丝氨酸被甘氨酸所取代，导致抗性的产生[3]。三氮苯类除草剂通过氢键与Ser264的羟基和Phe265的氨基于氨基酸在PQ结合相互作用，同时与Phe255的苯环产生疏水反应。氨基酸Ser264被Gly取代后三氮苯类除草剂在D-1蛋白上结合的氢键被移除，导致除草剂对D-1蛋白的亲和力下降，从而降低除草剂的生物活性或产生抗性[6]。该突变也是造成其他PSⅡ抑制剂抗性原因，较多研究结果表明其为杂草对PSⅡ抑制剂三氮苯类除草剂产生抗药性的分子机理[7-9]。【本研究切入点】目前对广西甘蔗田马唐对莠去津的抗性水平和抗性机理报道较少。【拟解决的关键问题】以广西甘蔗区马唐种群为研究对象，检测其对莠去津的抗性水平，并对抗性机理进行初探。厘清广西甘蔗田马唐抗性水平，初步探明研究马唐对莠去津的抗性机理，为指导科学合理用药和抗PSⅡ抑制剂类杂草的治理提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2014-2015年采集与广西14个县的甘蔗产区，直接采集成熟的马唐种子;在室内自然风干后，放入250 mL的棕色玻璃瓶中，置于种子储存柜中保存。供试仪器设备为:种子存储柜(杭州托普仪器有限公司);光照培养箱(宁波赛福有限公司); 3WPSH-500D型生测喷雾塔(农业部南京农业机械化研究所制);UV-1240型紫外分光光度计(日本岛津公司);Z326K高速冷冻离心机(德国hemmer公司);梯度PCR仪(德国耶拿分析仪器股份公司)。供试试剂包括:80%敌草隆水分散粒剂(以色列马克西姆阿甘工业公司);谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GSTs)酶活性测定试剂盒(南京建成公司);植物DNA提取试剂盒(Omega Biotek公司);Taq PCR StarMix试剂(北京康润诚业生物科技有限公司)等。

1.2 试验方法

1.2.1 整株植物测定法[10]在温室中将催芽后的30粒种子，均匀播种在直径为12 cm(直径)×10 cm(深)的塑料盆中，播种后马唐种子覆盖一层薄土，保证出苗率。试验时期温度为25～35℃。待植株长至2～3叶期间苗，保留长势基本一致的植株10株，3～4叶期间喷药处理。根据预实验结果用配置一系列浓度，0、0.3125、0.625、1.250、2. 500、5.000、10.000和20.000 g/L。每个处理3次重复，14 d后剪取地上部分，称量鲜物质质量，数据采用DPS统计分析软件处理，计算抑制中量IC50。

1.2.2 GSTs活性测定植株前处理同 1.2.3的方法，选择不同抗性种群进行GST酶活性研究，在3～4叶期喷浓度为1.25 g/L的莠去津，药后0、0.25、1、3、5、7 d采集马唐叶片，立即冷冻到-80℃冰箱中待用;每个处理3个重复。莠去津处理后GSTs酶液提取参照吴进才等的方法。称取采集的莠去津样品0.5 g，剪碎放入预冷后的研钵中，加入适量液氮快速研磨成细粉，再加入8 mL Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L，pH 8.0，含还原型谷胱甘肽25mmol/L，5%聚乙烯吡咯烷酮)，研磨匀浆，取上清液于14 000× g再离心10 min，上清液即为粗酶液。GSTs活性测定采用南宁建成有限公司生产的试剂盒。蛋白质的含量测定采用Bradford的考马斯亮蓝G-250法，以牛血清蛋白作标准曲线。

1.2.3 靶标基因突变检测 在NCBI上下载马唐psbA基因序列(KM453691.1)以及其他同源性高的psbA基因序列，设计上游引物为F1(5′-ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGCGAAAG-3′)，下游引物R3 (5′-AATAGGTAATCCTCTACCTTGAAGTTCTCGTCG-3′);叶片在4～5叶期收集，对psbA全长进行PCR扩增。马唐DNA提取采用Omega的植物提取试剂盒，按照说明书操作。总反应体系为20μl;正向引物与反向引物各1μl，模板DNA 1μl，Taq PCR Star-Max 10μl，ddH2O补足至20μl，PCR反应条件为:预变性95℃，5 min;35循环:变性95℃，30 s;退火55℃，1 min;延伸72℃，1min;最终延伸72℃，10 min;4℃保存。PCR反应结束后，取5μl PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带，然后进行胶回收测序。

2 结果与分析

2.1 马唐对莠去津的抗性水平

从测定结果(表1)可以看出，不同马唐生物型对莠去津的抗性水平差异较大，所测25个马唐生物型对莠去津的抗性水平差异较大，以崇左4号为最敏感种群，其中5个生物型(河池1号、来宾2号、崇左1号、崇左3号、百色2号等)对莠去津较敏感;5个生物型(南宁1号、崇左2号、贵港3号、百色1号、崇左5号)抗药性水平较低，抗药性指数为2～10;其余15个生物型对其抗性为中等水平，其中崇左1号抗药性指数最高，为37.2，南宁2号和南宁3号对莠去津抗药性指数也在30及上。

表1 马唐对莠去津抗性水平测定Table 1 The resistance level of different Digitaria sanguinalis populations to atrazine

2.2 莠去津对马唐GSTs活性的影响

以崇左4号敏感种群，分别选取抗性种群百色1号、柳州2号和贵港1号测定GSTs活性，研究GSTs活性与抗性的关系。因不同的种群GSTs酶活性本底不同，本研究采用相对活性研究GSTs的变化。经莠去津1.25 g/L处理后，所有种群GSTs相对活力开始上升，敏感种群在第1天达到最大值，是对照的1.64倍，然后开始下降，第5天之后趋于平缓。柳州2号和百色1号种群经药剂处理后，在第3 d达到最高值，为对照的1.73和1.55倍，之后下降，在第3天后的相对活性均高于敏感种群。然而贵港种群在药剂处理后GSTs相对活性一直低于敏感种群和另外两个种群，这说明除GSTs酶参与抗性，可能还有其他抗性机制的存在(图1)。

图1 抗性及敏感马唐种群茎叶组织GSTs活力变化Fig.1 The activity variation of GSTs in resistant and susceptible Digitaria sanguinalis

图2 马唐psbA基因DNA凝胶电泳检测Fig.2 Identification of psbA gene from Digitaria sanguinalis on 1.0 %agarose gel

2.3 靶标抗性检测

根据设计的引物进行PCR扩增，能很好的扩增出1000 bp左右的基因，见图2。通过对测序结果进行比对分析与NCBI提交的psbA基因序列相似度高于90%，证明该引物能很好的扩增出psbA基因。与敏感性种群对比，抗性种群psbA基因并没有发生突变，说明马唐对莠去津的抗性机制很可能是非靶标抗性。

3 讨 论

广西是我国主要的甘蔗生产地之一，莠去津因除草效果好、性价比高，受到农民的欢迎。然而使用年限较长，田间药效试验发现对马唐的防除效果明显下降的现象。周青等[11]通过田间和室内生物测定，发现河南安阳地区玉米田的马唐对阿特拉津、乙阿合剂产生抗性，田间用药剂量为推荐剂量的1倍以上。王金信[1]也报道了山东地区的马唐对莠去津产生了抗性。本研究结果证实了广西甘蔗田马唐对莠去津已经产生不同程度的抗药性，相对抗药性倍数最高达37.2。造成广西不同地点甘蔗田马唐抗性程度差异较大的原因，也与当地的用药历史、地理特征和作物种植方式有关。造成杂草抗性水平高低差异的原因还与其抗药机制不同有关。

一些学者已经证明杂草对莠去津的抗性主要机制是GSTs酶活性的增强和psbA靶标基因发生突变。高等植物体内谷胱甘肽-S-转移酶活性和解毒能力增强是许多杂草对三氮苯类、脲类及酰胺类除草剂的一种重要解毒机制[12-13]。谷胱甘肽-S-转移酶是一个多功能酶家族，它催化谷胱甘肽与多种亲电子和疏水底物相结合，使与之相结合的除草剂或者外源物排除体外从而达到解毒目的。玉米耐受三氮苯类除草剂是一个典型的例子，它因GSTs有较高的催化活性使三氮苯与谷胱甘肽轭合，因此玉米田能广泛使用三氮苯除草剂。GSTs在玉米体内的解毒机理已经被很好的阐述，该类酶均为二聚体，通过不同的亚基组成不同的同工酶，通过酶解除莠去津毒害。事实也证明，抗性和敏感性苘麻生物型体内类囊体均被莠去津相同程度地抑制，证明其抗药性不是由于D-1蛋白敏感性降低，三氮苯类除草剂莠去津与谷胱甘肽轭合作用的增强，提高了苘麻(Abutilon theophrasti)对除草剂的解毒能力，才是产生抗药性的主要原因。

靶标位点突变是导致杂草对PSII抑制剂抗性的另一个重要机制。目前已经报道的突变位点主要包括Val219Ile[14-16]，Phe255Ile[17]，Ser264Thr[18]，Asn266Thr[19]，Ala251Val[20]，Leu218Val和Ser264Gly[21]。不同的位点突变会导致不同的交互抗性。Val219Ile突变引起杂草对敌草隆、嗪草酮、利谷隆和丁噻隆等4种PSII抑制剂均能产生抗性。然而Ser264Gly突变仅能对三嗪类产生较高的抗性。为了预防杂草抗药性突变以及控制抗药性杂草的扩散、蔓延，应避免单一或同一作用机制除草剂;同时，还应及时诊断、鉴别，提供适应于当地抗药性杂草的防除技术措施，延缓杂草抗药性的发生，从而延长除草剂的使用寿命，保障杂草的有效治理和农业的可持续发展。

4 结 论

本研究结果表明，广西大部分甘蔗种植区马唐对莠去津产生抗性，抗性水平在低到中抗水平。选取不同抗性水平的3个种群对抗性机理进行初探，并没有发现靶标基因突变，GSTs酶活性的增强可能是抗性主要原因之一。

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(责任编辑 汪羽宁)

Resistance Level and M echanism s of Digitaria Sanguinalis to Atrazine in Sugarcane Field of Guangxi

WANG Yan-hui1，2，YANG Cai-ying1，MA Yong-lin1，2，HUANG Hui-ye1，2，GUO Cheng-lin1，2，QIN Jian-lin1，2，MA Yue-feng1，2
(1.Plant Protection Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China;2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Guangxi Nanning 530007，China)

【Objective】The resistance and resistancemechanism ofweed crabgrass Digitaria sanguinalis to atrazine in Guangxisugarcane field were studied to provide references for scientific control and resistancemanagement.【Method】The resistance level of25 Digitaria sanguinalis population collected in Guangxi sugarcane area was determined by pot experiment and the whole plantmethod.The resistancemechanisms were studied by using physiologicalbiochemical andmolecular biologymethods.【Result】As to the resistance of76%to atrazine in the population，Guigang-1 was the highest，which resistance index(RI)was37.2.Chongzuo-4 wasa sensitive strain，the relative vigor of the GSTs of Baise-1 and Liuzhou 2 population were significantly higher than thatof the sensitive population after3 days，and the psbA gene of D-1 protein on chlorophyll was sequenced，and the psbA gene of the resistant population were found to have nomutation，and the activity of GSTs was increased with the resistance of Digitaria sanguinalis to Atrazine.【Conclusion】The resistance of Digitaria sanguinalis to atrazine in Guangxi sugarcane field is low tomedium level.The resistance of the resistant population to atrazinemay be related to the enhancement of GSTs activity.

Digitaria sanguinalis;Atrazine;Resistance;GSTs;PsbA

S566.1

A

1001-4829(2017)8-1790-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.016

2017-03-29

国家自然科学基金项目(31460479);公益性行业(农业)科研专项(201303031);广西作物病虫害生物学重点实验室基金项目(14-045-50-ST-08);广西农业科学院基本科研业务专项(2015YT41)

王彦辉(1984-)，男，河南开封人，博士，副研究员，主要从事杂草抗药性研究，E-mail:wangyanhui@gxaas.net。