桂野生山金柑的倍性分析和SSR分子鉴定

李果果，刘要鑫，柴利军，叶俊丽，麦彩胜，欧智涛，陈香玲*

桂野生山金柑的倍性分析和SSR分子鉴定

李果果1，刘要鑫1，柴利军2，叶俊丽2，麦彩胜3，欧智涛1，陈香玲1*

(1.广西农业科学院园艺研究所/农业部南宁南亚热带果树科学观测实验站，广西南宁 530007;2.华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北武汉 430070;3.东兴市农业技术推广中心，广西东兴 538100)

【目的】研究‘桂野生山金柑’的遗传学特性，为柑橘种质资源的鉴定及创新利用提供理论依据。【方法】采用倍性分析和SSR标记相结合，对‘桂野生山金柑’进行遗传鉴定分析。【结果】倍性分析结果表明‘桂野生山金柑’是二倍体;从24对SSR引物中筛选出6对重复性好、条带清晰、多态性强的核基因组引物，在供试材料中获得等位基因条带共30条，其中具有多样性差异条带25条，多态性比例为79.17%。聚类分析的结果表明不同供试材料的遗传相似系数在0.600～0.802。【结论】‘桂野生山金柑’具有遗传特异性，不同于其他地区起源的山金柑或金柑，是一种新的柑橘种质资源。

桂野生山金柑;倍性分析;SSR分子标记;聚类分析

【研究意义】山金柑(Fortunella hindsii Swingle)为芸香科金柑属植物，别名山金豆、山金橘、山橘、香港金橘[1]，植株一年多次开花结果，果实成熟时金黄色，挂果期长，观赏性高[2]。近年来随着人类活动的不断扩大和生态环境的严重恶化，山金柑分布范围、面积、数量、种类都锐减，部分地区物种已消失殆尽。山金柑资源中存在单胚性植株[1]、四倍体植株[2]和实生苗早花早果特性植株[3]，是柑橘杂交育种和基因组学研究的良好材料。因此，收集山金柑资源并从分子水平上进行研究，对柑橘优良品种的选育具有重要意义。【前人研究进展】随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术在许多果树遗传多样性研究中得到了广泛应用[4-7]。SSR(simple sequence repeat)是一类由1～6个核苷酸为重复单位序列组成的串联重复序列，其标记需要的DNA量少，对DNA质量要求不高，具有共显性、数量丰富、多态性高、重复性好和检测简单等优点[8]。国内外研究人员利用SSR标记对柑橘属及金柑属植物的遗传多样性与亲缘关系进行了分析，如:Ferrante等[9]通过SSR分子标记精确检测了8个柑橘四倍体杂种的等位基因并探讨其起源问题;Amar等[10]用61对SSR引物对24个柑橘及其近缘属植物的多态性和识别能力进行了评价;张连峰等[11]选取了22对柑橘属SSR引物，其中有14对能在金柑属植物中扩增出带纹，表明柑橘属SSR引物在金柑属植物上具有一定的通用性;陈鹏等[12]对我国野生山金柑资源的形态特征和遗传多样性进行了系统分析，使用60对SSR引物分析了48份不同地区的样品，研究表明所有的样品遗传距离在0.37以内，亲缘关系都很近，为SSR分子标记在柑橘品种改良上的应用奠定了基础。【本研究切入点】广西被农业部规划为我国柑橘产业发展的优势区域[13]，蕴含了丰富的柑橘种质资源，但有关广西柑橘地方种质资源遗传多样性的研究相对较少。目前为止，在分子水平对广西野生山金柑资源的相关研究还处于空白。【拟解决的关键问题】以‘桂野生山金柑'为试材，对其倍性进行分析，并以其他地区的6份山金柑材料为参照，利用已公开发表的柑橘属及其近缘属SSR引物，采用分子标记技术研究供试材料的遗传多样性，以期了解广西野生山金柑种质资源并对其进行科学保护和创新利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

从2013年开始对广西东兴市发现的野生山金柑进行种质资源调查和样品采集，并将其嫁接保存于广西农业科学院园艺研究所柑橘资源圃内。通过3年的实地调查和研究，笔者发现该山金柑具有自己独特的植物学和生物学特性，并将其命名为‘桂野生山金柑'，于2015年通过了广西壮族自治区种子管理局的品种登记认证(桂登【果】2015021号)。本研究取2株‘桂野生山金柑'为供试材料。

SSR分子标记所用的其它6份种质资源材料分别是江西省赣州市多胚山金柑、浙江省台州市多胚山金柑、湖南省郴州市多胚山金柑、福建省龙岩市单胚山金柑1、福建省龙岩市单胚山金柑2、重庆市北碚区浏阳金柑;均采集于华中农业大学柑橘资源圃，通过资源搜集与保存获得。供试材料嫁接成活后，选取健康幼嫩叶片提取DNA，保存于-20℃备用。

1.2 倍性分析

参照张俊娥等[14]的检测方法，采用流式细胞仪(型号:PA-I，Partec公司，德国)对‘桂野生山金柑'的倍性进行检测，选取二倍体‘早花柠檬'的叶片作为对照，操作过程为:选取约0.5 cm2的幼嫩叶片于塑料皿中，加入400μl HR-A核裂解液，用刀片切碎叶片放置30 s，通过20～50μl的微孔滤膜将样品过滤到小试管里，加入1.6 mL HR-B DAPI染色液，染色30～60 s，然后上样品检测。Partec倍性分析仪测定样品中单个细胞核的DNA总量，DNA含量的分布曲线由仪器自动生成[15]。

1.3 DNA提取与PCR扩增

采用CTAB改良法提取柑橘叶片核基因组DNA[16]，具体方法稍作改动。DNA提取后用超微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)检测质量及浓度，并以高浓度保存于-80℃超低温冰箱。从24对引物中共筛选出6对多态性较好的引物，对7份山金柑材料(‘桂野生山金柑'重复2次)和1份金柑材料的DNA样品进行分析，6对引物组合即F10、Ma3-1047、BES-36、M2-14、F78和Ma2-1825(表1)。引物委托上海生工生物工程公司合成。PCR扩增体系总体积为20μl，反应液含有的组分和终浓度为:DNA模板100 ng，1×PCR buffer，dNTP 200μmol ·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1，1 Uit Taq酶，正反向引物各0.1μmol·L-1，其余为灭菌超纯水;扩增程序为:94℃预变性3 min，94℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸7 min，4℃20 min。扩增产物经0.6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，染色，拍照，用银染法得到被扩增的DNA谱带[17]。

表1 SSR分子标记所采用的扩增引物序列Table 1 Sequences of amplification primers used in the SSRmolecularmakers

1.4 聚类分析

每对SSR引物视为1个位点，每条多态性条带为1个等位基因。根据聚丙烯酰氨凝胶电泳后分子标记扩增条带的有无进行统计，有条带的记为1，没有条带记为0，构建(0，1)矩阵。构建的矩阵应用NTSYS-pc 2.10e软件采用简单匹配系数(Simplematching coefficient，SM)计算遗传相似系数，由此得到相似性系数矩阵，并根据SM相似性矩阵进一步进行UPGMA聚类分析，构建亲缘关系树图[18-19]。

2 结果与分析

2.1 倍性分析

从图1可以看出，流式细胞仪倍性分析结果表明‘桂野生山金柑'相同于对照‘早花柠檬'，为二倍体样本。

2.2 SSR扩增的多态性分析

从24条SSR引物中筛选出6条重复性好、条带清晰、多态性丰富的引物(表2)，利用这6条引物扩增到30个位点，其中多态性位点25个，平均多态性比率为79.17%。不同引物扩增的多态性条带数量为2～7条，平均每个引物产生的多态性条带数量为4.17条，多态性比率较高，说明本研究中的样品间存在的遗传差异较大，且‘桂野生山金柑'在遗传性上明显有别于其他试验材料，具有遗传特异性。6条引物的扩增结果谱带见图2。

2.3 聚类分析

8份柑橘种质的SSR聚类树形图3显示，不同品种或资源材料遗传相似系数在0.600～0.802。以遗传相似系数0.600为阈值，供试材料可划分为2组，其中‘桂野生山金柑'和江西省赣州市多胚山金柑材料为一个类群，浙江省台州市多胚山金柑材料、湖南省郴州市多胚山金柑、福建省龙岩市的2

图1 ‘桂野生山金柑'的倍性分析Fig.1 Ploidy analysis of GuiWild Shanjingan

份单胚山金柑材料和重庆市中柑所的浏阳金柑为一个类群。当遗传相似系数为0.802时，桂野生山金柑和江西省赣州市多胚山金柑材料即可分为不同的类别，浙江省台州市多胚山金柑和湖南省郴州市多胚山金柑相似系数为0.802，福建省龙岩市的2个单胚山金柑材料的相似系数为0.702，浏阳金柑和其他几种材料的遗传距离较远。由此可知，‘桂野生山金柑'与其他地区的山金柑、金柑资源遗传差异较大，具有自己的独特性。

3 讨 论

‘桂野生山金柑'除了和江西省赣州市多胚山金柑在遗传相似系数为0.802时可聚在一起，和其他地区山金柑及金柑材料的遗传距离为0.600，表明桂野生山金柑和其他材料均有较大的遗传差异，说明地理因素对亲缘关系也有很大的影响，这与前人的研究结果相类似[18-19]。陈鹏等[12]在进行中国野生山金柑资源调查以及分析遗传多样性时共收集到江西、湖南、福建、广东和浙江的野生山金柑样品275份，采用SSR标记后的聚类分析结果表明基本上各省的样品都聚在一起，部分地理位置相距较近的样品则聚在一起。本研究未能大范围验证桂野生山金柑的遗传背景与地理因素的关系，但主要是为验证‘桂野生山金柑'的遗传特异性，SSR分析样本的取样地点数量有限，在柑橘众多的类群中，枳属、金柑属、柑橘属中的多数种类均原产中国，在中国有着悠久的栽培历史[20]，现已查明广西拥有枳属、金柑属、柑橘属3个属的235个品种(系)[23]。柑橘童期长，多数品种为多胚，遗传背景复杂，这些特性给柑橘育种及遗传转化等研究带来了一定困难。前人研究表明，山金柑实生苗童期短，播种后一至两年便可开花结果，能够达到早开花、早结果、杂种后代品种早鉴定的目的[3，22]。笔者团队经过3年的实地调查和采样观察，明确在广西东兴收集的‘桂野生山金柑'材料为单胚性类型，一年内可多次开花、结果。单胚类型的山金柑材料，可以克服珠心胚障碍，如果用组织培养等技术将其加以培养，获得纯合系，不仅可为柑橘常规育种提供材料，还可用于功能基因组及遗传图谱构建等方面的研究。除此之外，利用童期较短的山金柑作为遗传转化材料，建立并优化其高效再生和遗传转化体系，将使山金柑有望成为果树中的模式植物。而‘桂野生山金柑'可较好的符合这些特性，有待进一步挖掘其在柑橘育种和基因组学研究中的潜在价值。

表2 SSR引物扩增结果Table 2 The amplification results of SSR primers

图2 不同材料的SSR扩增谱带Fig.2 SSR profiles of different samples

图3 SSR标记不同材料的UPGMA聚类分析Fig.3 UPGMA dendrogram of different samples based on SSRmarkers

野生资源和地方种质具有十分丰富的遗传多样性，对于评价品种资源间的关系具有重要意义[23-24]。‘桂野生山金柑'是广西为数不多的野生山金柑资源，是区域气候条件下形成的特色柑橘资源，蕴含特异基因资源，对于研究广西金柑属植物的演化历史及关系等具有重要意义。作者在实地调查采样中了解到，当地仍有一些野生资源由于环境恶化和人为破坏而逐渐消失，因此必须进一步加强对野生资源和地方种质的保护、研究和开发利用，为柑橘产业的健康发展做出贡献。

4 结 论

‘桂野生山金柑'为二倍体，通过对筛选出的6对条带清晰、重复性好、多态性强的SSR引物进行扩增，结果表明‘桂野生山金柑'具有遗传特异性，明显区别于其他地区起源的山金柑或金柑，是一种新的种质资源。

[1]邓秀新.中国柑橘品种[M].北京:中国农业出版社，2008:190.

[2]陈杰忠.果树栽培学各论[M].北京:中国农业出版社，2003:4.

[3]李怀福，胡小三.山金柑实生苗童期的研究[J].特产研究，2005 (1):23-25，39.

[4]耿 攀，阮小凤，杨 勇，等.柿属植物种质资源遗传多样性的SSR分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38 (12):190-196.

[5]潘丽梅，朱建华，秦献泉，等.广西龙荔遗传多样性的ISSR分析[J].果树学报，2011，28(5):814-819.

[6]陈 娇，王小蓉，杨浩茹，等.基于SSR标记的四川野生中国樱桃遗传多样性和居群遗传结构分析[J].园艺学报，2013，40 (2):333-340.

[7]赵 爽，苏淑钗，陈志钢，等.基于SSR的辽宁铁岭地区平榛遗传多样性与居群遗传结构分析[J].果树学报，2016，33(1):24 -33.

[8]罗 兵，孙海燕，徐港明，等.SSR分子标记研究进展[J].安徽农业科学，2013，41(12):5210-5212，5246.

[9]Ferrante SP，Lucretti S，Reale S，etal.Assessment of the origin of new citrus tetraploid hybrids(2n=4x)by means of SSR markers and PCR based dosage effects[J].Euphytica，2010，173(2):223 -233.

[10]Amar M H，BiswasM K，Zhang ZW，et al.Exploitation of SSR，SRAP and CAPS-SNP markers for genetic diversity of Citrus germplasm collection[J].Scientia Horticulturae，2011，128(3):220-227.

[11]张连峰，何 建，冯 焱，等.金柑属及其近缘属植物亲缘关系的SSR分析[J].果树学报，2006，23(3):335-338.

[12]陈 鹏.中国野生山金柑种质资源调查及遗传多样性研究[D].华中农业大学硕士学位论文，2011:17-27.

[13]邓秀新.国内外柑橘产业发展趋势与柑橘优势区域规划[J].广西园艺，2004(4):6-10.

[14]张俊娥，刘继红，邓秀新.采用倍性分析仪鉴定柑橘愈伤组织的遗传变异[J].遗传学报，2003，30(2):169-174.

[15]谢宗周，邓秀新，陈腾士，等.“桂橙一号”的遗传鉴定[J].南方园艺，2010，21(3):3-6.

[16]程运江，伊华林，庞晓明，等.几种木本果树DNA的有效提取[J].华中农业大学学报，2001，20(5):481-483.

[17]Bassam B J，Caetano-Anollés G，Gresshoff PM.Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J].Analytical Biochemistry，1991，196:80-83.

[18]刘 勇，吴 波，刘德春，等.江西柑橘地方品种资源及野生近缘种SSR分子标记[J].江西农业大学学报，2005，27(4):486-490.

[19]刘 通，邓崇岭，程玉芳，等.利用SSR和SRAP技术研究广西柑橘种质遗传多样性[J].华中农业大学学报，2016，35(2):23 -29.

[20]廖振坤.湖南柑橘种质资源评价及主要病害分子鉴定[D].湖南农业大学博士学位论文，2007.

[21]沈丽娟，高克义，李志宏，等.发挥广西柑桔优势之浅见[J].广西园艺，2007(1):8-10.

[22]张建成.红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPYS、CsLCYB)功能分析与crtB转基因对柑橘类胡萝卜素合成的影响[D].华中农业大学博士学位论文，2009:71-72

[23]刘建军，陈克玲，胡 强，等.特色地方柑橘资源“资阳香橙”的初步研究[J].西南农业学报，2008，21(6):1658-1660.

[24]刘冰浩，邓崇岭，陈传武，等.广西地方柑橘资源的ISSR分析[J].果树学报，2015，32(6):1001-1006.

(责任编辑 汪羽宁)

Ploidy Analysis and SSR M olecular Identification of GuiW ild Shanjingan

LIGuo-guo1，LIU Yao-xin1，CHAILi-jun2，YE Jun-li2，MAICai-sheng3，OU Zhi-tao1，CHEN Xiang-ling1*
(1.Horticulture Research Institute，Guangxi Academy of Agriculture Sciences/Nanning Investigation&Experiment Station of South Subtropical Fruit Trees，Ministry of Agriculture，Guangxi Nanning 530007，China;2.College of Horticulture&Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Ministry of Education，Hubei Wuhan 430070，China;3.Agricultural Technology Extension Center of Dongxing City，Guangxi Dongxing 538100，China)

【Objective】In order to provide a theoretical basis for the identification and utilization of GuiWild Shanjingan，its genetic characteristics was studied【Methods】Using ploidy analysis and SSR molecular marker to analyze the genetic diversity of GuiWild Shanjingan.【Results】The ploidy analysis result showed thatGuiWild Shanjingan was diploid.6 pairs of SSR primerswith good repeatability，high polymorphism and clear bands were screened from the 24 pairs of SSR primers.A total of 30 allele stripes were successfully observed，among them，25 bands were polymorphism.The polymorphic rate was 79.17%.Genetic similarities caculated by cluster analysis ranged from 0. 600-0.802.【Conclusion】GuiWild Shanjingan was significant different from Shanjingan or Jingan originated from other origions，itwas a new cultivar with genetic specificity.

GuiWild Shanjingan;Ploidy analysis;SSR molecularmarker;Cluster analysis

S666

A

1001-4829(2017)8-1872-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.030

2017-04-21

广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2016YM 44，桂农科2015YT51，桂农科2015JZ101);广西农业厅重点科技项目(201307);国家现代农业(柑橘)产业技术体系专项桂中南柑橘综合试验站(CARS-27)

李果果(1987-)，女，河南宝丰人，硕士，助理研究员，主要研究方向为柑橘品种选育和栽培技术推广，*为通讯作者，E-mail:cxl@gxaas.net。