荔波瑶山鸡TGFβ3基因多态性与繁殖性状的相关性

吴松成，朱丽莉，唐继高，伍革民

荔波瑶山鸡TGFβ3基因多态性与繁殖性状的相关性

吴松成，朱丽莉，唐继高，伍革民*

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005)

【目的】为探明荔波瑶山鸡TGFβ3基因与繁殖性状的关系，寻找可作为鸡繁殖性状的遗传标记。【方法】针对TGFβ3基因设计6对引物，采用PCR测序法筛选多态位点，并利用荔波瑶山鸡母系60个个体进行繁殖性状的关联分析。【结果】荔波瑶山鸡TGFβ3基因有17个多态位点，TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)和1755(A→G)位点各300日龄产蛋量、首次就巢日龄、首次就巢持续时间、首次就巢至重新开产间隔和300日龄就巢次数间呈显著或极显著相关(P＜0.05或P＜0.01);3343(C→T)与首次就巢持续时间、首次就巢至重新开产间隔和300日龄就巢次数均呈显著或极显著相关(P＜0.05或P＜0.01);3540(C→T)与开产日龄、300日龄产蛋量和首次就巢持续时间均呈显著或极显著相关(P＜0.05或P＜0.01);4786(C→T)和7471(G→A)分别与300日龄产蛋量和首次就巢日龄均呈显著相关(P＜0.05);7263(C→T)与首次就巢持续时间呈显著相关(P＜0.05)。【结论】TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786(C→T)、7263(C→T)和7471(G→A)与就巢性状关联显著，可作为降低就巢性提高繁殖力的辅助选择标记。

TGFβ3基因;基因多态位点;荔波瑶山鸡;繁殖性状

【研究意义】荔波瑶山鸡是贵州省的优良地方鸡品种资源之一，具有耐粗饲、抗逆性强、适应性强、肉质鲜美细嫩等特点，但因开产日龄、产蛋量、就巢性等重要经济性能偏低限制其产业化发展[1]。因此，筛选影响荔波瑶山鸡高繁殖力的主效候选基因，阐明其繁殖性状的控制调节机理，对荔波瑶山鸡优良种质资源的保护及利用具有重要意义。【前人研究进展】TGFβ(transforming growth factor-β，转化生长因子-β)是TGFβ超家族成员之一，是一种二聚体多肽，相对分子量为25 kDa的蛋白，最初以无活性的前体蛋白形式合成，主要通过独特的转膜Ser/Thr激酶受体实施生物学应答[2]。研究表明，TGFβ存在于大多数正常细胞及组织中，广泛参与细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、创伤愈合、胚胎发育、血管生成、纤维化、细胞凋亡及机体免疫系统等生理过程[3]。目前共发现5种TGFβ异构体，在哺乳动物中己鉴定出3种，分别为TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，位于不同的染色体上，但其生物学作用相似，且在氨基酸序列上具有极高的同源性，均含有7个外显子[4]。TGFβ1在卵巢组织中高表达，与卵泡发育、颗粒细胞的增殖、分化和排卵有关[5];大白猪的TGF-β1基因多态性与产仔数间显著关联(P＜0. 05)[6]。TGFβ2位于卵泡膜细胞和黄体细胞中，可以调节颗粒细胞和黄体细胞中抑制素和活化素的产生[7];在猪颗粒细胞中TGFβ2会抑制FSH诱导的cAMP应答元件结合蛋白的转录激活[8]。TGFβ3在牛卵泡的颗粒细胞以及膜细胞中，TGFβ3mRNA的表达水平远高于TGFβ1和TGFβ2[9];TGFβ3基因在湖羊的生殖器官表达相对较高，在高产组与低产组间差异极显著(P＜0.01)[10]。【本研究切入点】以上研究结果表明，TGFβ3在动物卵泡生长和发育过程中有十分重要的调控作用。【拟解决的关键问题】采用PCR测序法筛选多态位点，并分析TGFβ3基因多态性与繁殖性状的关联性，寻找TGFβ3基因的多态位点作为繁殖性状遗传标记的可行性，以期为荔波瑶山鸡的选择性育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鸡群选自贵州省贵阳市乌当区百宜乡洛坝村种鸡场的荔波瑶山鸡母鸡，60只，群体一致性较好，性能较为稳定，采用常规饲养管理方式个体笼养。翅下静脉采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存，用于提取基因组DNA。

1.2 性状测定

120日龄母鸡转入产蛋舍单个笼养至300日龄，逐个测定开产日龄、开产体重、就巢性等繁殖性状，测定方法按照NY/T 823-2004[11]进行。

1.3 基因组DNA提取及引物设计

采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒提取血样中的DNA。根据GenBank中鸡的TGFβ3基因序列(登录号:NC-006092.3)，由天根生化科技有限公司合成6对引物(表1)检测TGFβ3基因在荔波瑶山鸡60个个体中的基因型遗传变异情况。

1.4 PCR扩增及测序

PCR反应体系20μl:DNA模板1μl，上下游引物各1μl，2×Taq PCR MasterMix试剂10μl，加ddH2O至20μl。PCR反应参数:95℃预变性6 min;95℃变性30 s，特定温度(各引物的退火温度)退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，委托诺赛基因组研究中心有限公司纯化回收后进行双向测序。

1.5 数据处理

使用DNAstar软件对测序结果进行校正，进入基因库网站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN软件分析SNPs变异导致蛋白质编码变异情况，利用Spss18.0软件采用单因子方差分析方法分析基因型与繁殖性状的相关性。

表1 用于荔波瑶山鸡TGFB3基因型检测的引物信息Table 1 Primers used in detection of TGFβ3genotype in Liboyaoshan Chicken

2 结果与分析

2.1 多态位点及遗传多态性

从表2可知，6对引物在荔波瑶山鸡TGFB3基因中共检测出17个多态位点，其中引物1检测出2个多态位点，均位于外显子1上;引物2检测出2个多态位点，分别位于外显子2和内含子2上;引物3检测出5个多态位点，均位于内含子3上;引物4检测出1个多态位点，位于外显子4上;引物5检测出4个多态位点，1个位于外显子5上，3个位于内含子5上;引物6检测出3个多态位点，2个位于外显子6上，1个位于内含子5上。TGFβ3基因17个多态位点的多肽信息含量在0.06～0.38。

表2 荔波瑶山鸡TGFB3基因的多态位点及其遗传多态性Table 2 Polymorphic sites and genetic polymorphism of TGFβ3 gene in Liboyaoshan Chicken

表3 荔波瑶山鸡TGFB3基因多态位点与不同繁殖性状的关联性Table 3 TGFβ3 gene polymorphic sites and their correlations related to different production traits in Liboyaoshan Chicken

2.2 17个多态位点与繁殖性状的关联性

TGFβ3基因的17个突变位点分别位于外显子1的53(T→C)和140(T→C)，外显子2的1653(C→T)，内含子2的1755(A→G)，内含子3的3343 (C→T)、3428(T→C)、3464(A→T)、3525(A→T)和3540(C→T)，外显子4的4183(C→T)，外显子5的4786(C→T)，内含子5的5019(A→G)、5039(C→T)、5066(C→T)和7214(A→G)，外显子6的7214 (A→G)、7263(C→T)和7471(G→A)。经关联分析，外显子1上53(T→C)，外显子2上的1653(C→T)，内含子2上1755(A→G)，内含子3上3343(C→T)和3540(C→T)，外显子5上4786(C→T)，外显子6上7263(C→T)和7471(G→A)位点分别与不同繁殖性状存在显著或极显著相关(P＜0.05或P＜0.01)，其余9个突变位点与荔波瑶山鸡的繁殖性状关联不显著(表3)。

2.3 8个关联位点与繁殖性状的相关性

从表4可知，TGFβ3基因53(T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786 (C→T)、7236(C→T)和7471(G→A)8个关联位点与繁殖性状的相关性。其中，53(T→C)位点变异导致蛋白质第135位天冬酰胺发生同义突变[N( AUU→ACC)]。位点53变异将基因型分为TC、TT和CC，TT型的开产日龄分别比CC型和TC型晚23.17和19.85 d。CC型的300日龄产蛋量分别比TC型和CC型多49.95和54.17枚。CC型的首次就巢日龄比TC型推迟104.36 d，比TT型推迟85. 48 d。CC型的首次就巢持续时间比TT型和TC型短15.25和12.52 d;首次就巢至重新开产间隔时间比TT型和TC型短6.06和8.42 d;300日龄就巢次数比TT型和TC型少2.06和2.51次。

1653(C→T)位点变异导致蛋白质第209位精氨酸发生同义突变[R(CGC→CGT)]，CT型的300日龄产蛋量分别比CC型少61.43枚，比TT型少34.43枚;试验期间CC型个体母鸡未表现出就巢行为，因此CC型的首次就巢日龄、首次就巢日龄持续时间、首次就巢至重新开产间隔时间、300日龄就巢次数均与CT型和TT型呈极显著差异。1755(A→G)位点GG型的300日龄产蛋量分别比AG型和AA型多59.92和43.27枚;首次就巢日龄分别比AG型和AA型晚152.50和106.11 d;首次就巢至重新开产间隔分别比AG型和AA型早7.15和7. 19 d;300日龄就巢次数分别比AG型和AA型少2. 22和2.02次。3343(C→T)位点C型的首次就巢持续时间分别比CT型和TT型短9.16和10.14 d;首次就巢至重新开产间隔分别比CT型和TT型短5.86和5.93 d;300日龄就巢次数分别比CT型和TT型少1.54和1.92次。3540(C→T)位点TT型的开产日龄分别比CT型和CC型晚18.5和30.66 d;300日龄产蛋量分比CT型和CC型少27.77和 24.77枚;首次就巢持续时间比CC型长15.78 d。4786(C→T)位点变异导致蛋白质第322位异亮氨酸发生同义突变[I(AUU→AUC)];CC型的300日龄产蛋量分比CT型和TT型少56.47和46.75枚;

首次就巢日龄分别比CT型和TT型晚82.17和57. 33 d。7263(C→T)位点变异导致蛋白质第322位脯氨酸发生同义突变〔P(CCC→CCU)〕，CT型的首次就巢持续时间比TT型长11.53 d。7471(G→A)位点AA型的300日龄产蛋量分比GG型和GA型少58.00和54.07枚;首次就巢日龄分别比GG型和GA型晚87.09和71.67 d。

表4 荔波瑶山鸡TGFB3基因8个关联位点与不同繁殖性状的相关性Table 4 Correlations between 8 relevant sites of TGFB3 gene and different production traits in Liboyaoshan Chicken

3 讨 论

目前，对鸡TGFβ3基因的研究主要在鸡的肌肉脂肪沉积、肝脏代谢和鸡蛋壳强度的相关性方面，如TGFβ3基因对文昌鸡蛋壳强度有显著影响(加性作用)，T2T2基因型个体比T1T1基因型的蛋壳强度值高15.45%(P＜0.05)，比T1T2基因型高12.50 %(P＜0.05);TGFβ3基因对蛋壳强度以加性方式作用，其加性效应值为0.209(P＜0.05)[12]。TGF β3与Wnt-10α和Catenin-β等细胞外信号因子，协同调控IMF在矮小型鸡肌肉组织中沉积的信号通路中发挥了重要作用[13]。通过鸡细胞系过表达miR-122证明其对TGFβ3的调控在mRNA水平，表明miR-122可能通过调控TGF-β3基因在鸡肝脏代谢中发挥调控作用[14]。目前，尚未见TGFβ3基因核苷酸变异与鸡就巢性、产蛋量等繁殖性状的相关性报道。研究表明，荔波瑶山鸡TGFB3基因上53 (T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3540(C→T)、4786(C→T)和7471(G→A)6个SNP变异位点不同基因型间的300日龄产蛋量、首次就巢持续时间存在显著或极显著相关，该基因可作为繁殖性状标记辅助选育的候选基因。

4 结 论

荔波瑶山鸡TGFβ3基因有17个SNP，其中53 (T→C)、1653(C→T)、1755(A→G)、3343(C→T)、3540(C→T)、4786(C→T)、7263(C→T)和7471(G→A)8个多态位点与荔波瑶山鸡繁殖性状存在显著或极显著相关(P＜0.05或P＜0.01);外显子1、外显子2、外显子5和外显子6上各自存在1个SNP位点引起相应编码氨基酸种类的改变。荔波瑶山鸡TGFβ3基因的多态性与产蛋量呈显著或极显著相关(P＜0.05或P＜0.01)，该基因可能是影响其产蛋量的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因，可作为繁殖性状标记辅助选育的候选基因。

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(责任编辑 冯 卫)

TGFβ3 Gene Polymorphism and Correlations between TGFβ3 Gene and Reproduction Traits in Liboyaoshan Chicken

WU Song-cheng，ZHU Li-li，TANG Ji-gao，WU Ge-min*
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary in Guizhou Academy of Agricultural Science，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】This study aimed to explore the correlations between TGFβ3 gene and reproduction traits in Liboyaoshan Chicken and seek geneticmarketsof chicken reproduction trait.【Method】The correlationsbetween TGFβ3 gene and reproduction traitsare determined by analyzing 60 Liboyaoshan hens based on PCR technology.【Result】There are17 polymorphic sites in TGFβ3 gene of Liboyaoshan Chicken. 53(T→C)，1653(C→T)and 1755(A→G)sites are related to total egg number from 120 to 300 d age(EN300)，age at first broodiness behavior(AFBB)，duration of age at first broodiness behavior(DAFBB)，interval of age at first broodiness behavior between anew laying (IAFBBA)and times of broodiness behavior from 120 to300 d of age(TBB300)significantly or very significantly.3343(C→T)site is related to AFBB，IAFBBA and TBB300 significantly or very significantly.3540(C→T)site is related to AFE，EN300 and DAFBB significantly or very significantly.4786(C→T)and 7471(G→A)site is significantly related to EN300 and DAFBB respectively.7263(C→T) site is related to DAFBB significantly.【Conclusion】53(T→C)，1653(C→T)，1755(A→G)，3343(C→T)，3540(C→T)，4786(C→T)，7263(C→T)and 7471(G→A)sites of TGFβ3 gene are significantly related to reproduction traits，which indicates that these polymorphic sites can be used as assistant selection markers for improvement of reproductive capacity of Liboyaoshan Chicken.

TGFβ3 gene;Polymorphic site;Liboyaoshan Chicken;Reproduction trait

S831

A

1001-4829(2017)8-1823-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.040

2016-11-29

贵州省联合基金项目“瑶山鸡ONECUT1基因的CDS区克隆、差异表达及与生产性状关联分析”[黔科合LH字(2015)7067];贵州省基金项目“瑶山鸡就巢性选育关键基因筛选”[黔科合J字(2014)2102];贵州省农业动植物育种项目“瑶山鸡新品系选育”[黔农育专字(2014)008];贵州省农业科学院2014年博士基金项目“瑶山鸡STAT5基因变异检测及与产蛋性状关联分析”

吴松成(1966-)，男，贵州荔波人，学士，助理研究员，从事家禽遗传育种与养殖技术研究，E-mail:13885151440@ 163.com，Tel:13885151440，*为通讯作者:伍革民，E-mail:wgmabcdef@163.com。