大菱鲆弧菌耐药性初探

2017-09-15郑怀东李小进黄萍萍徐小雅张劲松石峰

中国水产 2017年9期

文/郑怀东李小进黄萍萍徐小雅张劲松石峰

大菱鲆弧菌耐药性初探

文/郑怀东1李小进1黄萍萍1徐小雅1张劲松2石峰2

抗菌药在水生动物细菌性传染病的控制中起到了非常重要的作用。但是，长期以来，由于人们关于水生动物致病菌对各种抗菌药物敏感性的变化缺乏了解，在养殖过程中盲目的滥用抗菌药，加重了水生动物越来越严重的耐药性，使抗菌药对水生动物细菌性疾病的控制效果越来越差。不但造成药物浪费，还延误病情，给水产养殖业造成严重的损失。根据全国水产技术推广总站部署，2016年4月～2016年10月，我站从葫芦岛市兴城市人工养殖大菱鲆体内分离致病性菌株，测定了其对抗菌素类药物的敏感性，初步研究情况如下。

一、材料与方法

1.供试药物

诺氟沙星、盐酸诺氟沙星、盐酸多西环素、盐酸土霉素、氟苯尼考、红霉素、氨苄西林、甲砜霉素、硫酸新霉素、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶。

2.供试菌株

2016年4月～2016年10月，从葫芦岛市兴城市2个定点养殖场饲养的大菱鲆体中，选取有典型病症的个体进行活体解剖，选取新鲜组织和病灶部位分别接种于选择性培养基平板（弧菌的分离培养选用TCBS琼脂平板），28℃±1℃培养18h～24h，观察菌落特征，挑取可疑的单个菌落，接种于TSA培养基或普通营养琼脂平板上，28℃±1℃培养18h～24h以得到纯培养物。

3.供试菌株最小抑菌浓度的测定

按照日本化学疗法学会制定的标准法，将供试药物采用适宜的预溶剂溶解后，用灭菌蒸馏水分别稀释至1000.0μg/mL的浓度。按照倍比稀释法，将抗菌药物原液通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在96孔板中用MH肉汤稀释成10个梯度。首先，用移液器向第1孔～第11孔中分别加入100μL含有2%NaCl的MH肉汤。然后，向第1孔中加入100μL一定浓度的抗菌药物，之后按照倍比稀释法将抗菌药物稀释至第10孔，形成10个药物梯度，依次向96孔细胞培养板的第1孔～第10孔和第12个孔中加入106CFU/mL的菌悬液（分光光度计测定），每孔100μL；第11孔和第12孔分别作为阴性对照和阳性对照，每种药物做3个平行。28±1℃恒温培养箱中培养24h。观察各孔培养液中细菌的生长情况，以抑制细菌生长的药物最高稀释度作为测试药物的最小抑菌浓度（MIC）。

二、结果与分析

1.弧菌监测结果

（1）分离培养结果

2016年4月～2016年10月间，从葫芦岛市兴城市2个定点养殖场饲养的大菱鲆中共采集样品286份，分离培养出菌株共325株，其中弧菌属275株，采集率占总菌株数的84.6%。采集样品的时间、水温、大菱鲆数量、分离菌株数量见表1。

表1.菌株采集及分离情况

从表1可以看出，弧菌在辽宁省葫芦岛地区不同养殖场、不同月份都有检出，表明弧菌在该地区养殖大菱鲆体内广泛存在，常年均可分离得到病原菌，随季节和月份的变化，7月份～10月份分离出的弧菌数量多于4月份～6月份。

（2）鉴定结果

将分离得到的275株弧菌属菌株通过分子生物学（PCR）鉴定出12个种类，见表2。鉴定结果表明，大菱鲆弧菌的检出率最高，占总数的42.27%；其次是鱼肠道弧菌占到21.09%；灿烂弧菌、大西洋弧菌也占有一定数量，分别占到10.91%和9.82%；缓慢弧菌、嗜环弧菌、河口弧菌、魔鬼弧菌、溶藻弧菌、塔斯马尼亚弧菌，这几个种类的弧菌数量较少，所占比例在1.09%～2.91%之间；此外，某些月份还分离得到1株创伤弧菌和1株费氏弧菌，数量极少。通过对这275株弧菌属的种类鉴定，提示葫芦岛地区养殖大菱鲆过程中应注意这些优势菌的防治。

表2.275株弧菌菌株分离及鉴定结果（单位：株）

2.弧菌对抗菌药物的感受性

弧菌病是世界水产品养殖业危害最大的病源之一，是引起水生动物细菌性败血症等疾病的致病细菌。其宿主范围很广，包括养殖和野生鱼类，据报道，目前已有很多国家发生过弧菌病，侵染大约48种海水鱼类。本次从分离得到的275株弧菌中选取有代表性的104株，用13种抗菌药物对其进行药物敏感性试验，其对各种抗菌药物感受性测定结果如表3所示。

3.弧菌对抗菌药物的耐药性

不同抗生素药敏试验的感受性结果判定标准有所不同，参照美国临床实验室标准研究所（CLSI）发布的标准文件，对药物的敏感性及耐药性判定范围划分如下：诺氟沙星类、盐酸多西环素及盐酸土霉素（S敏感：MIC≤4μg/mL，I中敏：MIC=8μg/ mL，R耐药：MIC≥16μg/mL），氟苯尼考、甲砜霉素及硫酸新霉素（S敏感：MIC≤2μg/mL，I中敏：MIC=4μg/mL，R耐药：MIC≥8μg/ mL），红霉素（S敏感：MIC≤0.5μg/ mL，I中敏：MIC=1μg/mL～4μg/ mL，R耐药：MIC≥8μg/mL），氨苄西林（S敏感：MIC≤8μg/mL，I中敏：MIC=16μg/mL，R耐药：MIC≥32μg/mL），磺胺类（S敏感：MIC≤38μg/mL，R耐药：MIC≥76μg/ mL）。依照这一划分范围，将各种抗菌药物对各致病菌的MIC值测定结果进行判定，得出了各致病菌对各抗菌药物的耐药性结果。

（1）弧菌对抗菌药物的耐药性总体对比

药物敏感性实验结果详见表4。结果表明在大菱鲆体内所分离的弧菌对不同抗菌药物表现出不同程度上的敏感性和耐药性。盐酸诺氟沙星、诺氟沙星耐药率为5.77%，盐酸多西环素、氟苯尼考耐药率分别为12.50%和15.38%，保持了较高的敏感性，为预防和治疗葫芦岛地区弧菌类细菌病的首选药物。红霉素、盐酸土霉素耐药率为25%～33.65%，这两种药物保持着中度敏感性。氨苄西林、甲砜霉素耐药率为40.38%～44.23%，具有较低水平的敏感性。而硫酸新霉素耐药率为75.96%、磺胺类药物耐药率高达100%，是耐药的抗菌药。

表3.弧菌对各种抗菌药物的感受性（n=104株）

表4.弧菌对各种抗菌药物的敏感率和耐药率总体对比结果（单位：株）

（2）不同种类弧菌对抗菌药物的耐药性对比

由表5中的不同种类弧菌的耐药率结果对比得出，在几类敏感类药物中，诺氟沙星类药物对本年度所分离的多数弧菌株都有起到了有效的抑制作用，敏感率达到100%，其中溶藻弧菌仅对诺氟沙星类药物敏感，而嗜环弧菌对其不敏感。盐酸多西环素对该地区的鱼肠道弧菌、灿烂弧菌、缓慢弧菌的生长抑制效果明显，耐药率分别为4.3%、6.7%、16.7%，若这三种病原菌引起疾病时，推荐优先使用该药物。氟苯尼考对大西洋弧菌的抑菌效果显著，耐药率为6.3%，可以对其引起的疾病起到控制作用。在几类多数弧菌株敏感性不高的药物中，甲砜霉素对魔鬼弧菌和费氏弧菌起到很好的抑制效果，体现了不同菌株对不同药物的感受性并不是绝对的，而是相对的。

检出率最高的大菱鲆弧菌，氟苯尼考和诺氟沙星类药物对其抑制效果较好，成为治疗该病原菌疾病的首选药物。河口弧菌和魔鬼弧菌感受性较一致，对诺氟沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考均敏感。塔斯马尼亚弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌对多数供试的抗菌药物敏感性较高，对红霉素、盐酸土霉素、氨苄西林等几类不敏感药物的耐药率也仅为0%，得到了有效抑制。与其他弧菌株相比，嗜环弧菌对本试验的所有药物均表现出不同程度的耐药，耐药率多在50%～75%以上，仅对红霉素100%敏感，红霉素是抑制嗜环弧菌的唯一有效药物。此外，所有分离的弧菌株均对硫酸新霉素和磺胺类药物严重耐药。

（3）不同月份弧菌对抗菌药物的耐药性对比

不同月份弧菌对抗菌药物的耐药率对比结果见表6，除诺氟沙星类和氨苄西林外，各类药物普遍表现为9月～10月的耐药率低于4月～6月。结合本地区的实际生产和弧菌病流行情况，我们推测导致这一现象可能与当地大菱鲆养殖过程中的用药习惯有关。弧菌在全年均有检出，养殖户长期使用药物进行预防，但7月份～8月份的水温适宜大菱鲆生长，也是弧菌疾病发病率最低时期，养殖户用药较少，故使得9月份～10月份的耐药率有所降低。

三、结论与建议

1.关于弧菌监测和对抗菌药物的感受性结论

弧菌在该地区的养殖大菱鲆体内广泛存在，不同养殖场、不同月份都有检出，7月份～10月份分离数量较4月份～6月份有所增加。此次分离培养出弧菌属275株，鉴定出12个种类，其中大菱鲆弧菌的检出率最高；其次是鱼肠道弧菌、灿烂弧菌、大西洋弧菌；少量的缓慢弧菌、嗜环弧菌、河口弧菌、魔鬼弧菌、溶藻弧菌、塔斯马尼亚弧菌；极少量的创伤弧菌和费氏弧菌。

药敏结果显示，弧菌种属总体表现为对磺胺类药物和硫酸新霉素的耐药性最强，其次为甲砜霉素、氨苄西林。而对诺氟沙星类药物、盐酸多西环素、氟苯尼考、红霉素、盐酸土霉素敏感。

不同种类弧菌株多数对诺氟沙星类药物有极高的敏感性，其中溶藻弧菌仅对诺氟沙星敏感，而嗜环弧菌对其不敏感。鱼肠道弧菌、灿烂弧菌、缓慢弧菌对盐酸多西环素敏感性较高。大菱鲆弧菌、大西洋弧菌对氟苯尼考的敏感性较高。魔鬼弧菌和费氏弧菌对甲砜霉素有极高的敏感性。河口弧菌和魔鬼弧菌对诺氟沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考均敏感。塔斯马尼亚弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌对多数供试的抗菌药物敏感性较高，得到了有效抑制。而嗜环弧菌对多数供试的抗菌药物表现出不同程度的耐药，仅对红霉素敏感。所有分离的弧菌株均对硫酸新霉素和磺胺类药物严重耐药。

2.关于目前选择用药的建议

弧菌对诺氟沙星类药物、盐酸多西环素和氟苯尼考表现出了较高的敏感性，具有明显的抑制作用，建议可以作为抽样企业今后治疗和预防弧菌类疾病的首选药物。而红霉素、盐酸土霉素也相对的表现出了中度敏感性，一定程度上也能抑制住菌株的生长，治疗过程中，需要加大一定剂量。而氨苄西林、甲砜霉素敏感率较低，需要根据实际情况进行使用。而磺胺类药物及硫酸新霉素表现出了严重的耐药性，抽样企业弧菌株已经对这类药物产生了抗药性，在治疗时尽量不要使用。建议今后在养殖生产中使用药物时做到对症下药，根据MIC值选用有效治疗浓度，做到科学用药，合理减药。