浮游植物显微镜计数方法适用范围探究

杨萍萍

（大理白族自治州环境监测站云南大理671000）

浮游植物显微镜计数方法适用范围探究

杨萍萍

（大理白族自治州环境监测站云南大理671000）

通过采集洱海浮游植物样品对各显微镜计数方法进行比较，结果表明：全片法适用于浮游植物细胞密度低水体的测定，行格法适用于浮游植物细胞密度适中水体的测定，对角线法适用于浮游植物细胞密度适中或高水体的测定。

浮游植物；数量测定；显微镜

引言

浮游植物是指生活在水中营浮游生活的自养型生物，也被称为浮游藻类，已知淡水藻类有25000种左右，而中国已发现的淡水藻类约9000种[1]，浮游植物是水体生态系统的重要初级生产者，其种类组成和数量分布的生态学特征是水生生态系统的重要研究内容[1、2]。浮游植物对其所处的水生态环境反应灵敏，能够对水体营养状态的变化迅速做出响应，其种属组成及群落结构能够准确反映水环境现状，是评价水环境现状的重要指示生物[1]。

显微镜计数法是目前淡水浮游植物测定的基本方法。随着科技的发展，浮游植物测定还有分光光度法、荧光分光光度法、流式细胞显微镜计数法、库尔特计数法等。[3]但是这几种方法仅能够分析测定浮游植物细胞密度，显微镜计数法不仅可以测定水体中浮游植物细胞密度，还可以进行浮游植物的种属及群落结构分析，仍是目前进行浮游植物测定的主流方法。

目前国家尚未出台浮游植物测定的标准方法，实际应用中显微镜技术法还分为全片计数法、行格计数法、对角线计数法。[1、4]各种方法针对不同水体浮游植物存量存在不同的使用范围。为探究各种方法的优缺点及适用范围，采集洱海水样，通过浓缩、稀释处理调整样品浓度，分别用三种不同技术方法进行测定，比较分析各种方法利弊及适用范围。

洱海属于中营养湖泊，位于高原，浮游植物种属丰富。根据大理州环境监测站2013-2015对洱海浮游植物36期396组定性、定量标本测定结果，共采集鉴定到浮游植物8门71属。浮游植物种属丰富，细胞个体从大到小均有所涵盖，适宜作为浮游植物测定实验水样。

1 材料和方法

1.1 试剂和设备

鲁哥氏液，40 g碘溶于含碘化钾60 g的1 000 m L水溶液中；2.5 L有机玻璃采水器；Nikon 50i显微镜；显微镜数码相机；0.1 mL藻类计数框，20×20 mm，框内横竖各10格；22×22 mm盖玻片；100μl移液枪。[8]

1.2 水样的采集与制备

从洱海中采集水样，经初步测定，水样初始浓度为107个细胞/升。于相同点位相同时间共采集3个样品，用有机玻璃采水器采集表层水样1L，装入样品瓶，现场加入15ml鲁哥试剂固定。将两个样品分别进行稀释和浓缩，经稀释10倍调整浓度到106个细胞/升，浓缩10倍调整浓度至108个细胞/升。[8]浓度调整后，作为初始样品，针对三种浓度水样，待计数。

1.3 显微镜计数

分别用全片计数法、行格计数法、对角线计数法（分别简称：全片、行格、对角），对每一浓度样品计数，每个样品每种方法计数7次，报出7次计数结果及种属组成，并对计数时间、温度、湿度等实验条件进行记录。藻细胞分类等级定到属。[9]计数时，若破损细胞或叶绿体缺失则不计数。若计数过程中由于时间较长，水分蒸发导致装片产生气泡，则应重新制片计数。每个水样平行计数2次，计数结果与其平均值之差控制在±15%以内。

全片计数法：对计数框内100个小格的全部藻体进行计数；行格计数法：计数框每列或每行的10个小格组成一个长条，对计数框内第2、5、8条长条计数。与长条右侧或下刻度相交的个体计数，与左侧或上刻度相交的个体不计数。对角线计数法：计数框对角线上的十个小方格区域内的所有藻细胞逐一分类计数。破损细胞不计数。[5、6]

2 实验结果

2.1 数据结果

通过对三组样品采用不同方法计数，共获得浮游植物测定数据351组，其中每组包含浮游植物细胞密度及水样中浮游植物种属组成、计数时长（表1-3）。其中，108浓度样品由于水样中藻类细胞浓度高，藻类种属较多，根据行格计数法所用时间估算，若物镜倍数为20倍条件下，全片计数法平均计数时长约为2小时23分钟。计数时间较长，且装片在计数至50分钟左右（雨天温度13度，湿度68%）蒸发出现气泡，导致不能完成实验。若在物镜倍数为10倍条件下，除转板藻、新月藻等大型藻体外，大部分藻属细胞较小，计数较困难。单细胞藻类如小环藻、衣藻、蓝隐藻、蓝纤维藻、四角藻等在10倍物镜下较难分辨，故108样品浓度进行全片计数不可行。

表1 洱海水样三种藻类计数方法实验结果单位：个细胞/升

2.2 结果分析

从实验结果中得知，当水体中浮游植物细胞密度较低时，对角线法和行格法实验结果相近，相对标准偏差较高，测定出细胞种属数较全片法少。全片法相对标准偏差较低，结果稳定，所观察中出现的浮游植物种属较其他两种方法多。故全片法适用于浮游植物细胞密度低的水体的测定。

当水体中浮游植物细胞密度适中时，行格法和全片法相对对角线法相对标准偏差较小，结果较稳定，从浮游植物种属组成、浮游植物细胞密度结果、计数时长等综合分析，行格法较适用于浮游植物细胞密度适中的水体。

当水体中浮游植物细胞密度较高时，全片法已不能正常使用，此时行格法与对角线法测定出种属组成相近。行格法相对标准偏差较低，结果较稳定，但细胞密度测定结果较低，技术时间长。对角线法细胞密度测定结果与多种方法测定结果均值相近，计数时长适中，相对标准偏差在15%以内。故对角线法较适宜浮游植物细胞密度较高的水体。

2.3 各种计数方法比较

各种浮游植物显微镜技术方法优缺点比较。

表2 浮游植物显微镜计数方法对比分析

结语

浮游植物种类及群落结构分析对深入研究淡水浮游植物生理特征、群落结构及功能、在淡水生态系统中的作用都具有重要的科学意义。[1]显微镜计数法中对角线法、行格法、全片法在不同实验条件下具有各自的优缺点。

全片法测定结果稳定，测定出种属全；但工作量最大，不适用于高浓度浮游藻类样品。行格法实验测定耗时相对全片法短，测定样品速率适中；但在低浓度时测定结果不稳定，测定出种属少，对于高密度浮游植物水样，计数耗时较长，由于水分蒸发计数框内会产生气泡，影响计数结果的准确性。对角线法实验测定耗时短，测定样品速率高，对角线选取样品分布具有代表性；但在低浓度时测定结果不稳定，测定出种属少。全片法适用于浮游植物细胞密度低时的测定，行格法适用于浮游植物细胞密度适中情况下的测定，对角线法适用于水体中浮游植物细胞密度适中或较高时的测定。选择适当的浮游植物计数方法对浮游植物的研究十分重要，可以根据样本大小、便于分析、样品处理率等不同的需求选择最佳计数方法。

[1]钱奎梅，刘霞，陈宇炜，淡水浮游植物计数与定量方法湖泊科学2015，27（5）：767-775.

[2]李志勇，刘津，高东微等.瓶装饮用水中浮游藻类计数方法研究[J].食品科技.2009.34（7）:266-270.

[3]金玉，张瑜霞，李爱军等对角线法分析高密度浮游藻类数量的研究环境科学与技术，2013（36）

[4]张瑜霞，金玉，施择等富营养化水体藻类显微镜计数方法改进研究福建分析测试，2014，23（1）

[5]赵孟绪水库藻类监测原理与方法分析[J].广东水利水电.2010.8:61-63.

[6]刘晓江，施心路，齐桂兰等.淡水藻类在监测水质和净化污水中的应用[J].生物学杂志，2010，27（6）:76-78，86.

[7]张秋劲，何冬琼，于飞等.四川省重点流域浮游植物群落调查研究[J].中国环境监测，2012，28（5）:53-56.

[8]国家环境保护总局，水和废水分析方法编委会水和废水监测分析方法[M].北京：中国环境科学出版社.2002.

[9]胡鸿钧，魏印心.中国淡水藻类：系统、分类及生态[M].北京:科学出版社，2006.