玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表达及其降解毒素初步研究

柴成梁 常晓娇 王楠希 伍松陵 孙长坡

(国家粮食局科学研究院，北京 100037)

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表达及其降解毒素初步研究

柴成梁 常晓娇 王楠希 伍松陵 孙长坡

(国家粮食局科学研究院，北京 100037)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是由镰刀菌属产生的次生代谢物,是极易污染粮食作物的真菌毒素之一。ZEN具有强烈的雌激素样效应及致癌性，给人类和动物的健康造成巨大威胁。本研究在NCBI数据库中进行同源比对，获得了一些ZHD101降解酶的同源基因，其中，1个来源于真菌——杨盘二孢菌(Marssoninabrunnea)的蛋白序列与ZHD101具有32%的同源性，基因大小为861 bp。通过化学合成方法得到该全长基因，通过构建E.coli原核表达系统进行蛋白表达，蛋白经亲和色谱纯化后对ZEN分子进行降解活性验证，HPLC结果表明，该蛋白在6 h内对10 μg ZEN分子的降解率为98%，酶活为200U/mL，从而获得了1个新的ZEN降解酶基因。

玉米赤霉烯酮 ZEN降解酶基因 克隆 蛋白表达纯化

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)主要是由镰刀菌属(Fusariumspecies)产生的次生代谢物，是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素[1]，易受ZEN污染的粮食作物包括玉米、大麦、小麦、高粱和黑麦等[2]。ZEN的化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，其结构与雌性激素雌二醇(estradiol)的结构相似，ZEN能够与动物细胞膜上的雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合，引起ER的构象改变，ZEN/ER复合物被进一步转移至细胞核内，与雌激素效应元件结合，调节靶基因的转录与翻译，进而影响细胞的生长和分裂[3-4]。ZEN被摄入到哺乳动物体内，可引起哺乳动物阴道炎、假发情及发情周期延长、流产、不育以及畸形等的“高雌性激素症”(hyperestrogenism)[5-6]。ZEN通过食物链在人体内蓄积，可导致性早熟，甚至引起乳腺癌、食管癌等发病率增加[7-8]，对人类健康造成巨大威胁。

微生物降解法消除ZEN污染是利用微生物在代谢过程中产生的酶与ZEN作用，破坏ZEN分子的毒性基团，使其被降解或转化为无毒产物的过程。生物降解法降解ZEN特异性强、ZEN分子被转化效率高、不会引起环境污染，因此可科学有效地消除粮食作物中的ZEN污染，具有极好的应用前景[9]。目前国内外关于ZEN的生物降解研究已取得了一定的进展，筛选到了包括细菌、真菌在内的多株具有降解或转化ZEN活性的微生物[10]。首次将ZEN降解为无毒产物的研究者是El-Sharkawy和Abul-Hajj，他们发现1株丝状真菌——粉红粘帚霉Gliocladiumroseum，可将ZEN分子的内酯键打开，得到的降解产物无雌性激素活性[11]。日本研究者Takahashi等[12]发现的粉红粘帚霉ClonostachysroseaIFO7063，可破坏ZEN分子的内酯环，得到的降解产物无雌性激素活性，并通过进一步研究，得到了起降解作用的水解酶，克隆出了编码水解酶的基因ZHD101。目前，ZHD101蛋白的三维结构已经解析出，明确了ZHD101与ZEN分子的结合方式，为ZHD101在消减粮食中的ZEN污染提供了重要基础[13]。国内研究者程波财等[14]发现的ZEN降解酶基因ZEN-jjm，以及刘海燕等[15]发现的zlhx-6均对ZEN具有较好的降解效果。

本试验用ZHD101为模板，在NCBI数据库中进行序列比对，获得了一些ZHD101降解酶的同源序列，其中，一个来源于真菌——杨盘二孢菌(Marssoninabrunnea)的蛋白序列与ZHD101具有32%的同源性，基因大小为861 bp。通过化学合成方法得到该全长基因，通过构建PET30a表达载体，转化BL21(DE3)表达宿主，IPTG诱导进行蛋白表达，蛋白经亲和色谱纯化后与ZEN分子孵育，进行降解活性验证，用HPLC方法检测ZEN分子是否被降解，本研究提供了一个发掘ZEN降解酶的新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 引物和载体

试验所用引物列于表1中，试验中连接所用载体为PET30a载体由本实验室保存，采用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切，因此用于克隆目的基因的引物中也需要含有NdeI/XhoI、酶切位点或相应的同尾酶酶切位点(XhoI的同尾酶是SalI)。引物序列中包含保护碱基、限制性内切酶识别位点及一段与目的基因匹配的基因序列。

表1 引物列表

1.1.2 试剂、工具酶及培养基

高保真DNA聚合酶和Taq：TAKARA公司；限制性内切酶：TAKARA公司和NEB公司；T4 DNA连接酶：Promega公司；DNA marker和Protein marker：Genstar公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒碱裂解法小量提取试剂盒：中科瑞泰公司；dNTP和DNA荧光染料Goldview：北京鼎国昌盛生物技术公司；甲醇、乙腈(色谱纯)：北京DIKMA 公司；ZEN标准品：sigma公司。

LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去离子水定容至1 L，于121 ℃灭菌20 min，固体培养基加1.5%的琼脂粉；10×PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，加去离子水定容至1 L，用盐酸调pH至7.4，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试验仪器设备

PCR热循环扩增仪、电泳槽、恒压/恒流电泳仪、凝胶成像系统：Bio-rad公司；超声波破碎仪：美国Sonics公司；恒温摇床：瑞士Infors公司；高速离心机(低温)：Thermo公司；高速离心机(室温)：Eppendorf公司；亲和层析介质Ni-NTA：GE公司；e2695高效液相色谱仪、荧光检测器(2475)、xbridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美国Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 基因合成及体外扩增

根据Genebank中mbZHD的基因序列，委托苏州金唯智生物科技有限公司对mbZHD基因进行全合成，合成后基因克隆到pUC57 载体上。为表达分析，需将mbZHD基因克隆到PET30a载体上。应用DNASTAR.Lasergene.v7.1进行基因序列分析，设计一对引物如表1所示，引物由睿博兴科生物技术有限公司合成。运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)进行mbZHD的基因的体外扩增，PCR反应体系见表2。

表2 PCR扩增反应体系

PCR反应程序为(1)95 ℃变性5 min；(2)94 ℃变性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸时间根据基因片断长度计算)；(5)步骤(2)(4)进行30个循环；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

1.2.2 重组表达载体的构建

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物条带从琼脂糖胶上切下，按照中科瑞泰公司DNA回收试剂盒上的步骤进行回收。将回收后的PCR产物在37 ℃进行NdeI/SalI双酶切。将回收的酶切产物在4 ℃连接入PET30a载体。将连接产物加入100 μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上放置30 min，42 ℃热激90 s后，加入400 μL无抗性的LB培养基，37 ℃、180 r/min培养50 min(复苏)，然后将菌液涂到卡那霉素(Kanamycin，Kan)抗性的LB平板上，37 ℃放置过夜，次日挑取生长的单菌落进行阳性克隆鉴定。

1.2.3 阳性克隆的获得

挑取平板上的单菌落于1 mL Kan抗性LB液体培养基中37 ℃培养，3 h后进行PCR阳性克隆筛选。PCR鉴定为阳性后，测序，准确无误后确定该克隆为阳性克隆，按照中科瑞泰质粒小提试剂盒上的步骤进行质粒抽提，保存于-20 ℃。

1.2.4 mbZHD重组蛋白的诱导表达

将构建好的mbZHD质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在Kan抗性的LB平板上37 ℃培养过夜，次日挑取单菌落到10 mL LB培养基中在37 ℃培养摇床中200 r/min培养至较为混浊时，转接到1 L LB培养基中继续培养，待细菌生长到OD值为1左右时，将摇床温度降至15 ℃，加入0.5 mL浓度为0.6 mol/L的IPTG诱导表达过夜，次日收菌纯化蛋白。

1.2.5 mbZHD重组蛋白的纯化

将过夜表达的菌体离心收集，弃上清，加入30 mL重悬缓冲液，将细菌沉淀悬起后超声破碎细菌，将破碎的细胞悬液转入高速离心管中，高速离心后把上清加入到Ni-NTA亲和柱中，让其流过亲和介质。用10倍柱体积的漂洗缓冲液漂洗亲和介质，洗掉非特异性结合的杂蛋白，用5 mL 洗脱缓冲液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，-80 ℃保存。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行mbZHD蛋白的表达纯化分析。

1.2.6 ZEN降解酶活性测定

取纯化的mbZHD蛋白50 μL，加入到含ZEN质量浓度为10 μg/mL的eppendorf管中，以不加mbZHD蛋白的同浓度ZEN溶液作对照，37 ℃反应6 h，100 ℃加热10 min终止反应，用旋转蒸发仪蒸干反应体系，加入1 mL甲醇，超声萃取，经0.22 μm滤膜过滤后，用高效液相色谱检测，根据ZEN浓度的变化来分析mbZHD蛋白对ZEN是否具有降解活性。高效液相色谱检测ZEN的色谱条件为：色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，xbridge) ；流动相：超纯水/色谱级乙腈=50/50(V/V)；流动相流速：1.0 mL/min；色谱柱温度设定：25 ℃；进样量：10 μL； 荧光检测器：激发波长(Ex)∶ 274 nm，发射波长(Em)∶ 440 nm；采集时间：13 min。

ZEN生物降解率的计算方法：取纯化的mbZHD蛋白，加入到含ZEN质量浓度为10 μg/mL的eppendorf管中(反应组)，以不加mbZHD蛋白的同浓度ZEN溶液作对照，终止反应后，用高效液相色谱检测，对照组样品和反应组样品的ZEN收峰面积之差即为降解掉的ZEN。

测得的酶活性用酶活单位U/mL表示，1 U/mL酶活定义为1 mL纯化后的酶液在1 min内降解1 ng ZEN毒素。

2 结果与分析

2.1 mbZHD基因序列的获得

以ZEN降解酶ZHD101(264 aa)为模板，在NCBI数据库中进行同源比对，获得1个可能降解ZEN分子的降解酶基因mbZHD，该基因来源于1株真菌——杨盘二孢菌，表达产物为286个氨基酸。通过将mbZHD与ZHD101比对发现，mbZHD与ZHD101具有32%的同源性，如图1所示。

2.2 mbZHD基因PCR

按表2的PCR反应体系，以合成的mbZHD全长基因为模版，通过PCR方法扩增mbZHD(1-286 aa)基因，PCR结果如图2所示。

2.3 阳性克隆的获得

将构建好的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布Kan抗性LB平板，挑取生长的单菌落进行菌落PCR鉴定，结果如图3所示。PCR鉴定为阳性后，测序，准确无误后确定该克隆为阳性克隆。

注：黑色标记的氨基酸为2蛋白中的相同氨基酸；黑色方框内的氨基酸为2蛋白中性质相似氨基酸；无标记的氨基酸为2蛋白中不相同氨基酸。图1 mbZHD与ZHD101蛋白序列比对图

注：1泳道是目的基因mbZHD；M为DNA Marker。图2 mbZHD基因琼脂糖凝胶电泳

注：1泳道为空质粒对照；2、3、4泳道为转入含目的基因质粒的单菌落；M为DNA Marker。图3 阳性克隆的PCR鉴定

2.3 mbZHD蛋白的表达纯化

将过夜表达mbZHD蛋白的菌体超声破碎，转入高速离心管中高速离心后，把上清用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。因为目的蛋白mbZHD融合有组蛋白标签，能与Ni-NTA亲和介质结合，从而与杂质蛋白分开，然后用高浓度咪唑将目的蛋白从Ni-NTA亲和介质上洗脱下来，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行mbZHD蛋白的表达纯化分析，根据目的蛋白的大小判断其在凝胶上的位置，结果如图4所示。

注：1泳道是表达mbZHD蛋白的菌体超声破碎后的样品；2泳道是从Ni-NTA亲和柱上洗脱下来的样品；M是Protein Marker。图4 mbZHD蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4 mbZHD蛋白对ZEN的降解活性测定

取纯化的mbZHD蛋白50 μL，加入到含ZEN质量浓度为10 μg/mL的eppendorf管中(反应组)，以不加mbZHD蛋白的同浓度ZEN溶液作对照，37 ℃反应6 h后，用高效液相色谱检测，在上述色谱条件下，对照组样品在保留时间RT=10.715 min处有强吸收峰，而反应组样品基本无ZEN目标峰检出，经吸收峰面积计算，已有98%的ZEN分子被降解，降解酶酶活为2×102U/mL。

注：在保留时间RT=10.715 min处，无吸收峰(实线)的是反应组样品，有吸收峰(虚线)的是对照组样品。图5 反应组样品与对照组样品HPLC图

3 讨论与结论

本研究以ZEN降解酶ZHD101(264aa)为模板，在NCBI数据库中进行同源比对，获得1个可能降解ZEN分子的降解酶基因mbZHD，该基因来源于1株真菌——杨盘二孢菌，表达产物为286个氨基酸。通过构建E.coli原核表达系统进行蛋白表达，蛋白经纯化后对ZEN分子进行降解活性试验，结合高效液相色谱检测，证实了该蛋白具有降解ZEN活性，从而发现了1个新的ZEN降解酶基因，说明通过在NCBI数据库中进行同源比对从而发现ZEN降解酶基因的方法确实可行。

通过将mbZHD与ZHD101比对发现，mbZHD与ZHD101具有32%的同源性。通过在相同降解酶浓度条件及相同的酶活定义下，比较ZEN降解酶mbZHD、ZHD101、ZEN-jjm对ZEN的降解活性发现，mbZHD对ZEN的降解活性为200 U/mL，而ZHD101与ZEN-jjm对ZEN的降解活性为mbZHD的2倍，即为400 U/mL。显然，分析造成这些降解酶对ZEN降解活性存在差异的原因尤为重要。下一步的工作是试图解析mbZHD的蛋白结构，通过比较mbZHD与ZHD101的结构差异以及对ZEN的降解活性差异，来判断此类水解酶的哪些氨基酸残基对降解ZEN分子起到关键作用，以此为依据对ZEN降解酶进行分子改造，提高降解酶活性，为ZEN降解酶在消减粮食及其副产物中的ZEN污染提供基础。

[1]Zinedine A, Soriano J M, Molto J C, et al. Review on the toxicity, occurrence, metabolism, detoxification, regulations and intake of zearalenone: an oestrogenic mycotoxin[J]. Food and Chemical Toxicology, 2007, 45(1):1-18

[2]Richard J L, Payne G A, Desjardins A E, et al. Mycotoxins:risks in plant, animal and human systems[J]. CAST Task Force Report, 2003,139:101-103

[3]Riley R T. Mechanistic interactions of mycotoxins: the oretical considerations[M] //Sinha K H, Bhatnagar D. Mycotoxins in Agricultureand Food Safety. New York: Marcel Dekker, Inc., 1998:227-253

[4]Ahamed S, Foster J S, Bukovsky A, et al. Signal transduction through theRas/Erk pathway is essential for the mycoestrogen zearalenone-induced cell-cycle rogression in MCF-7 cells[J]. Molecular Carcinogenesis, 2001, 30(2):88-98[5]Mirocha C J, Christensen C M, Nelson G H. F-2 (zearalenone) estrogenicmycotoxin fromFusarium[J]. Microbial Toxins. 1971：107-138

[6]Hueza I M, Raspantini P C, Raspantini L E, et al. Zearalenone, anestrogenic mycotoxin, is an immunotoxic compound[J]. Toxins, 2014, 6(3):1080-1095

[7]Sáenz C A, Bongiovanni A M,Conde de B L. Anepidemic of precocious development in Puerto Ricanchildren[J]. Journal of Pediatrics, 1985, 107(3):393-396

[8]Kuiper-Goodman T, Scott P M, Watanabe H. Risk assessment of the mycotoxin zearalenone[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 1987, 7(3):253-306

[9]Karlovsky P. Biological detoxification of fungal toxins and its use in plantbreeding, feed and food production[J]. Natural Toxins, 1999, 7(1):1-23

[10]Sun X, He X, Xue K S, et al. Biological detoxification of zearalenone by Aspergillus niger strain FS10[J]. Food & Chemical Toxicology, 2014(72):76-82

[11]El-Sharkawy S, Abul-Hajj Y J. Microbial cleavage of zearalenone[J]. Xenobiotica , 1988, 18(4):365-371

[12]Takahashi-ando N, Kimura M, Kakeya H, et al. A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone:enzymepurification and gene cloning[J]. Biochemical Journal, 2002, 365(1):1-6

[13]Wei Peng, Tzu-Ping Ko, Yunyun Yang, et al. Crystal structure and substrate-binding mode of the mycoestrogen-detoxifying lactonase ZHD from Clonostachys rosea[J]. Rsc Advances, 2014(4):62321-62325

[14]程波财, 史文婷, 罗洁, 等. 玉米赤霉烯酮降解酶基因(ZEN-jjm)的克隆、表达及活性分析[J]. 农业生物技术学报, 2010, 18(2):225-230 Cheng B C, Shi W T, Luo J, et al. Cloning of zearalenone-degraded enzyme Gene (ZEN-jjm) and its expression and activity analysis[ J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2010, 18(2):225-230

[15]刘海燕, 孙长坡, 伍松陵, 等. 玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 中国粮油学报, 2011, 26( 5):12-17 Liu H Y, Sun C P, Wu S L, et al. Expression of zearalenone degrading enzyme gene from gliocladium roseum in Pichia Pastoris GS115[ J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2011, 26(5):12-17.

Preliminary Study on Prokaryotic Expression and Its Degradation Activity of a New Zearalenone-Degradation Enzyme(mbZHD)

Chai Chengliang Chang Xiaojiao Wang Nanxi Wu Songling Sun Changpo

(Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037)

Zearalenone (ZEN) was a mycotoxin produced mainly by fungi belonging to the genusFusariumwhich frequently contaminated crops. ZEN had an intense estrogen-like effects and was extremely carcinogenic, which posed great threats to the health of animals and human. Through homologous alignment in NCBI, some homologous

sequences of ZHD101 degradation enzyme were found, and one of them which came from fungus -protein sequences ofMarssoninabrunnea-was found to be 32% homologic to ZHD101, and the gene size was 861bp. To determine its ZEN-degrading activity, the full-length gene was obtained by chemical synthetic method, and the protein expression was made by constructingE.coliExpression System HPLC results showed that the degradation rate of protein aganst 10 μg ZEN within 6 h was 98%; the enzyme activity was 200 U/mL and a new ZEN-degradation enzyme was successfully obtained.

zearalenone，ZEN-degradation enzyme，gene cloning，protein expression and purification

国家科技支撑计划(2015BAK43B01)，公益性行业(粮食)科研专项(201513006)

2016-06-17

柴成梁，男，1984年出生，助理研究员，生物化学与分子生物学

孙长坡，男，1975年出生，研究员，粮油微生物与质量安全

Q71

：A

：1003-0174(2017)08-0029-06