MiR-126、血管内皮生长因子的表达与微血管密度在上皮性卵巢癌组织中的变化

秦巧红，，

(郑州大学第三附属医院妇科，河南 郑州 450052)

MiR-126、血管内皮生长因子的表达与微血管密度在上皮性卵巢癌组织中的变化

秦巧红，任琛琛，刘星烁

(郑州大学第三附属医院妇科，河南 郑州 450052)

目的探讨miR-126、血管内皮生长因子(VEGF)的表达与微血管密度(MVD)在上皮性卵巢癌组织中的变化及意义。方法采用qRT-PCR检测21例正常卵巢组织、23例良性卵巢肿瘤组织及45例上皮性卵巢癌组织中miR-126表达水平，采用免疫组化法检测VEGF蛋白表达及MVD。结果MiR-126在上皮性卵巢癌组织中的表达明显低于正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织(P<0.05)；VEGF阳性率和MVD在上皮性卵巢癌组织中明显高于正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织(P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中miR-126、VEGF及MVD与FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。结论MiR-126、VEGF可能与上皮性卵巢癌的发生、发展、肿瘤异常血管营养及侵袭转移有关。

上皮性卵巢癌；微小核糖核酸；血管内皮生长因子；微血管密度

卵巢癌是女性生殖系统常见3大恶性肿瘤之一，恶性程度最高，病情发展快，且由于缺乏有效的早期诊断指标，疾病发现时多已为中晚期。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miR)是近年来新发现的一类长约21～25个核苷酸的小分子RNA，主要参与调控细胞生长分化、能量代谢、凋亡等各个重要而基本的细胞生理过程，并已经被证实与肿瘤的发生、发展、转移、预后有着密切的关系[1-5]。MiR-126在多种肿瘤中表达下调，可能在肿瘤发生过程中发挥抑癌基因的作用[6-7]，但其在卵巢癌中的研究国内外报道甚少且存在差异，miR-126可以靶向调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，通过与VEGF mRNA的3’非翻译区中的互补位点结合，在翻译水平抑制VEGF的表达。因此本课题针对miR-126在上皮性卵巢癌组织中的表达情况进一步研究，并发现与之密切相关的VEGF及微血管密度(microvessel density，MVD)在上皮性卵巢癌组织中的变化情况。

1 材料与方法

1.1材料来源选取2010年3月至2016年8月郑州大学第三附属医院妇科收治的病理科存档的经病理学证实的89例组织标本，包括正常卵巢上皮组织21例、良性卵巢肿瘤组织23例、上皮性卵巢癌组织45例。其中正常卵巢组织取材于因良性宫体疾病行附件切除患者；良性卵巢肿瘤组织取材于术前未经化疗、放疗等辅助治疗的良性卵巢肿瘤患者；上皮性卵巢癌组织取材于术前未行化疗、放疗等辅助治疗的上皮性卵巢癌患者。45例上皮性卵巢癌患者年龄27～73(47.6±5.5)岁；按FIGO(2013)分期标准：Ⅰ、Ⅱ期12例，Ⅲ、Ⅳ期33例；组织学分级：低分化25例、中分化11例、高分化9例；病理类型：浆液性卵巢癌29例，黏液性卵巢癌8例，子宫内膜样癌4例，透明细胞癌4例；淋巴结转移：有34例，无11例。术中切取卵巢部分组织立即置液氮中速冻后移入-80 ℃冰箱中保存，用于qRT-PCR检测；部分组织用质量分数4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，用于免疫组化检测。

1.2主要试剂TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒及SYBR Master Mix均购自美国Tiangen公司；引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。兔抗人VEGF一抗购自美国Santa Cruz公司，S-P试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京博奥森公司。

1.3免疫组化S-P法检测VEGF蛋白的表达及MVDVEGF主要定位于细胞质和细胞膜,细胞质含有棕黄色颗粒的细胞计为阳性，选择5个高倍镜下计数的卵巢上皮组织细胞数和阳性细胞个数,得出阳性细胞百分率,采用半定量积分法判定结果，以其阳性细胞百分比计，≤5%为阴性(-)，6%～25%为弱阳性(+)，26%～50%为中等强度阳性(++)，≥51%为强阳性(+++)，其中后三者均记为阳性。CD34以血管内皮细胞染为棕黄色作阳性标准。肿瘤细胞间质内孤立的棕黄色血管内皮细胞或管腔面积<8个红细胞，且管壁无肌层者代表1条单独的微血管在低倍镜(×200)下检查微血管染色情况，取5个癌巢间质血管最多的视野即血管热点区，换高倍镜(×400)计数每个区域的MVD,平均值即作为该例标本的MVD值。

1.4qRT-PCR检测miR-126表达1)RNA提取、检测：使用miRNA提取试剂盒，在液氮下将卵巢组织研磨成粉状，紫外分光光度计测定总RNA纯度及浓度；2)miR-126反转录、扩增：取3 μL总RNA，按逆转录试剂盒说明书反转录成cDNA,反应体系为10 μL，逆转录反应条件：37 ℃孵育60 min；用qRT-PCR检测，以U6 snRNA作为内参，取cDNA 1 μL,总反应体系为20 μL；反转录条件：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 60 s,共40个循环。以2-△ct表示组织中目的基因表达量相对于内参基因的表达倍数。引物序列见表1。

表1 MiR-126相关引物序列

2 结果

2.13种卵巢组织中miR-126表达水平上皮性卵巢癌组中miR-126相对表达量(ln值)为-1.759(-3.506～-0.001)，低于正常卵巢组织[0.796(-0.578～2.810)]、良性卵巢肿瘤组织[-0.659(-1.194～0.001)](P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中miR-126相对表达量(ln值)与上皮性卵巢癌的FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表2。

表2 MiR-126表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系

2.23种卵巢组织中VEGF表达水平3种卵巢组织中VEGF表达水平总体比较差异有统计学意义(P<0.001)。上皮性卵巢癌组织中VEGF阳性表达率[80.00%(36/45)]明显高于正常卵巢肿瘤组织[23.81%(5/21)]和良性卵巢肿瘤组织[52.17%(12/23)](P<0.017)。见表3。

2.33种卵巢组织中MVD计数结果3种卵巢组织中MVD总体比较差异有统计学意义(P<0.001)。MVD值在上皮性卵巢癌组织(22.013±3.329)中明显高于正常卵巢组织(6.133±2.090)、良性卵巢肿瘤组织(11.478±2.337)(P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中MVD与FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表4。

2.4上皮性卵巢癌组织中miR-126、VEGF、MVD之间的相关性MiR-126与VEGF呈负相关(r=-0.532，P<0.05)；miR-126与MVD呈负相关(r=-0.589，P<0.05);VEGF与MVD呈正相关(r=0.703，P<0.05)。

表3 VEGF表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系 n(%)

表4 MVD与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系

3 讨论

MiR是一类不编码蛋白质的单链小RNA[5]，在肿瘤疾病中miR可以作为癌基因或抑癌基因，在卵巢癌中miR也发挥重要作用，但miR-126在上皮性卵巢癌中的研究却存在着差异。本研究结果显示，miR-126在上皮性卵巢癌组织中的表达低于正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织，且miR-126表达与上皮性卵巢癌的FIGO分期及淋巴结转移有关，提示该指标可能与上皮性卵巢癌预后相关，有作为上皮性卵巢癌的预后检测指标的潜能。VEGF是目前发现的最重要的促进血管新生的因子，能够促进肿瘤血管新生，使肿瘤细胞更易于侵入和穿透血管，实现肿瘤的侵袭和转移，研究[6]表明VEGF可能参与了上皮性卵巢癌的发生、发展，并在上皮性卵巢癌的侵袭转移中有着重要作用。MVD是评估血管生成情况的指标之一[7]。本研究结果显示，VEGF、MVD在上皮性卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织，且两者均与上皮性卵巢癌的FIGO分期及淋巴结转移有关，提示VEGF、MVD可能参与卵巢癌的发生、发展。总之，在上皮性卵巢癌发生、发展过程中，可能由于miR-126表达的下降，对VEGF的表达抑制减弱，促进肿瘤血管的生成，这为上皮性卵巢癌的治疗提供新的靶点选择。

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ChangesofMiR-126,VascularEndothelialGrowthFactorandMicrovesselDensityintheEpithelialOvarianCancer

QIN Qiaohong, REN Chenchen, LIU Xingshuo

(DepartmentofGynecology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of miR-126 and vascular endothelial growth factor (VEGF), microvessel density (MVD) in the epithelial ovarian cancer.MethodsqRT-PCR was performed to detect the expressions of miR-126 in the 21 cases of normal epithelial ovarian tissues, 23 cases of benign epithelial ovarian neoplasm tissues, 45 case of epithelial ovarian cancer tissues; immunohistochemical staining S-P method was performed to detect VEGF and microvessle density.ResultsThe expression of miR-126 in the epithelial ovarian cancer was significantly lower than those in the normal epithelial ovarian tissues and the benign epithelial ovarian neoplasm tissues (P<0.05); VEGF and MVD in the epithelial ovarian cancer were significantly higher than those in the normal epithelial ovarian tissues and the benign epithelial ovarian neoplasm tissues (P<0.05)； miR-126, VEGF and MVD were related with the FIGO pathological types and lymph node metastases (P>0.05).ConclusionMiR-126 and VEGF play an important role in the occurrence, progression, angiogenesis, invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer.

epithelial ovarian cancer; micro ribonucleic acid; vascular endothelial growth factor; microvessel density

秦巧红(1983-)，女，主治医师，主要从事妇科肿瘤方面的研究。E-mail：qin_qiaohong@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.04.001

R737.31;R730.23

A

1673-5412(2017)04-0277-04

2016-10-23)