SOCS3在内毒素诱导神经胶质细胞耐受模型中的变化

谢泽锋 李苹 辛岗 陈城 李康生 苏芸⋆

·论著·

SOCS3在内毒素诱导神经胶质细胞耐受模型中的变化

谢泽锋 李苹 辛岗 陈城 李康生 苏芸⋆

目的 探讨内毒素（脂多糖，lipopolyssacride，LPS）体外诱导小鼠大脑皮质神经胶质细胞耐受模型中细胞因子信号转导抑制因子（Suppressor of Cytokine Signaling 3，SOCS3）信号的变化。方法 分离纯化新生小鼠大脑皮质星型胶质细胞和小胶质细胞，采用LPS进行预刺激（先采用0.01µg/ml LPS刺激18h后，再用1µg/ml LPS刺激24h）诱导LPS耐受，同时设置未刺激组、0.01µg/ml LPS和1µg/ml LPS单次刺激组对照。收获细胞与上清液，采用ELISA法检测星型胶质细胞与小胶质细胞IL-6水平，Western blot 检测SOCS3蛋白表达水平。结果 LPS预刺激组产生IL-6水平与未刺激对照组，0.01µg/ml单次刺激组、1µg/ml单次刺激组相比水平升高，其中星型胶质细胞与1µg/ml单次刺激组比较升高明显（P＜0.05）；星型胶质细胞与小胶质细胞预激组SOCS3表达均有升高趋势。结论 SOCS3-IL-6信号轴与中枢神经细胞群LPS耐受效应密切相关，参与中枢LPS耐受细胞负控信号的重新调整。

神经胶质细胞 内毒素耐受 细胞因子信号转导抑制因子

2 结果

2.1 LPS诱导神经胶质细胞耐受模型培养上清液中IL-6水平 星形胶质细胞产生IL-6的水平，0.01μg/ ml，1μg/ml单次刺激组及预刺激组水平明显升高（P＜0.05）。其中预刺激组中与1μg/ml单次刺激组比较水平升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。对于小胶质细胞，0.01μg/ml、 1μg/ml LPS单次刺激组、预刺激组IL-6水平比未刺激对照组亦有升高趋势，其中预刺激组中比对照组水平升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图1）。

图1 LPS诱导神经胶质细胞耐受模型中IL-6的水平

图2 LPS诱导神经胶质细胞耐受模型中SOCS3蛋白的表达水平

2.2 LPS诱导神经胶质细胞耐受模型SOCS3蛋白表达水平的影响 星形胶质细胞经LPS预处理后SOCS3蛋白水平的表达比1μg/ml单次刺激组略增加（见图2A，2B）。小胶质细胞经LPS预处理后SOCS3蛋白水平的表达比1μg/ml单次刺激组有增加趋势（图2C，2D）。神经胶质细胞LPS耐受模型建立：接种于6孔板的星型胶质细胞和小胶质细胞按照处理方式分为未刺激对照组、0.01μg/ml LPS单次刺激组、1μg/ml LPS单次刺激组、预刺激组。其中预刺激组先用10ng/ml LPS预处理18h，再用1μg/ml LPS刺激24h。收集细胞培养上清液，-30℃保存待用。（3）SOCS3表达的检测：细胞收获后采用Western blot检测SOCS3的蛋白水平。裂解细胞蛋白，样品经SDS-PAGE凝胶电泳、电转移、封闭后加入抗SOCS3稀释抗体4℃孵育过夜。加辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育后增强化学发光法显色，Image J软件根系条带信号强度获取各条带的吸光度值。计算蛋白相对表达量：SOCS3蛋白吸光度值/内参照β-actin比值。（4）IL-6水平的检测：酶联免疫吸附试验检测神经胶质细胞培养上清液中IL-6 水平，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

LPS耐受效应通常表现为面临LPS再次刺激时，靶细胞释放炎性细胞因子减少，从而削弱全身性炎症损伤。星形胶质细胞与小胶质细胞是介导中枢内免疫反应的活性细胞，在多种脑部疾病中如某些神经退行性疾病、脑缺血发生明显炎症反应时，出现过度激活，多种分子表达上调及炎性因子的释放增加［7-8］。有实验表明，先以小剂量LPS预处理，可降低再次脑卒中、脑创伤炎症损伤，由此减轻脑组织功能障碍［3，9］；采用LPS预处理后亦可抑制某些免疫细胞的功能，进而延缓实验变态反应性脑脊髓炎的病程［10］。本资料结果显示采用小剂量LPS预激时，星形胶质细胞和小胶质细胞分泌TNF-α的水平降低［11］；而IL-6水平增加。表明通过LPS预处理诱导靶细胞耐受模型，在不同类型的细胞中不同免疫指标其反应性具有差异，表现为部分参数为激活反应。在LPS耐受诱导过程中，某些负性调节因子如SOCS3蛋白成员参与了调节过程。SOCS3在多种细胞因子的激活（尤其是gp130细胞因子超家族成员如IL-6）的JAK/STAT途径中起负反馈调节作用［5-6］，且能抑制某些细胞因子引发的STAT依赖性信号转导［12］。研究表明，SOCS1、SOCS3基因缺陷的小鼠无法诱导LPS耐受，而增加SOCS1的表达可明显抑制NF-κB的激活［13］。本资料结果显示SOCS3的水平在LPS预处理后表达有增加趋势，这与其他具有LPS耐受效应靶细胞的变化趋势一致，表明其SOCS3确实参与LPS预激诱导神经胶质细胞耐受信号分子的再调整，从而抑制某些促炎细胞因子产生后引发的信号转导。虽然呈现LPS预激后星形胶质细胞和小胶质细胞产生IL-6的水平增加，但靶细胞依然可以调动相关的负反馈因子如上调SOCS的表达来限制其生物学效应，这也进一步证明LPS耐受不是某种特定细胞单一的抑制反应，而是一系列复杂适应性调节后产生的综合效应。另外，由于中枢尚存在其他分子或细胞群参与IL-6与SOCS3间的多点调控［14-15］。且考虑到不同种类细胞因子的产生是动态变化，因此，SOCS3的诱导表达在时效上存在差异，即使在两类细胞LPS耐受诱导中其上调幅度较低，但一定程度上还是能削减炎性因子的效应，由此最终避免中枢细胞群的不可逆性损伤。

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Objective To study the changes of SOCS3 expression in LPS-induced mice glia cell tolerant（majorly referring to astrocytes and microglia）. Methods Mice astrocytes and microglia were purified in vitro. Then the astrocytes and microglia were pretreated with 0.01ug /ml of LPS for 18 hours，and

the second times of treatment with 1ug/ml of LPS for 24 hours to induce LPS tolerance. Non-treated group，0.01ug/ml of LPS treated group，1ug/ml of LPS treated-group were also designed as control. After the treatment，the cells and cultured supernatants were harvested for determination of IL-6 by ELISA，SOCS3 expression by western blot. Results IL-6 levels were increased with LPS treatment（P＜0.05）. In astrocytes，IL-6 level was higher in LPS-pretreated group than that in lug/ml of LPS-treated group（P＜0.05）. LPS pretreatment tended to enhance the expression of SOCS3 protein. Conclusion SOCS3 pathway can involve in the re-adaption LPS tolerance in the neuroglia，which is one of the negative modulator of cellular signal in LPS tolerance of central nervous system.

Neural glia Endotoxin tolerance SOCS3

1 材料与方法

国家自然科学基金项目（81001340，81471622）；广东省医学科研基金项目（A2015211）；广东省优秀青年教师培训计划（Yq2013079）；广东省高水平大学建设项目子项目（2015013），汕头大学创新强校青年教师人才培育项目

515041 汕头大学医学院第一附属医院（谢泽锋）

515041汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室（李苹 辛岗 陈城 李康生 苏芸）

*通信作者

内毒素（LPS）耐受，是机体或细胞的一种适应性调节机制，可通过不同剂量LPS或LPS类似物处理诱导产生［1-2］。LPS耐受情况下，促炎介质及其他的损伤因子受到重新调节，由此防止过度炎症损伤效应［3］。研究表明，LPS预处理诱导免疫耐受，可减轻脑部炎性损伤，这可能是外周或中枢免疫细胞通过重新调节其功能和信号所致［4］。细胞因子信号转导抑制因子（Suppressor of Cytokine Signaling，SOCS）是细胞因子信号转导负控通路中的重要分子，参与尤其是gp130细胞因子超家族成员如IL-6多种细胞因子的激活［5-6］。2014年1月至2016年12月作者在体外星形胶质细胞与小胶质细胞中建立LPS耐受模型，检测两类细胞中SOCS3与IL-6的表达水平，探讨中枢神经系统细胞群LPS耐受诱导机制。

1.1 材料 包括购自GIBCO公司的DMEM/F12、0.25%Trypsin-0.02%EDTA、抗生素；四季青公司的胎牛血清；Sigma公司的内毒素（LPS，Escherichia coli，O111：B4）；星形胶质细胞和小胶质细胞标志物抗体（Abcam公司）：抗GFAP抗体，抗CD11b抗体；SOCS3抗体（Santa Cruz公司），辣根过氧化酶标记二抗、细胞裂解液购自碧云天；IL-6 ELISA 试剂盒（达科为）。1.2 方法 （1）小鼠大脑皮层神经胶质的培养与分离纯化：无菌分离新生C57BL/6小鼠（出生24h内）大脑皮质，去除成纤维细胞后放置培养。培养第2天，第4天，之后再按1次/5～7d更换培养基，直至细胞长满培养瓶。长成单层的胶质细胞用0.05%胰酶37℃消化约10min，胰酶液经终止、离心后培养1d。再将细胞培养瓶固定于定轨摇床中进行水平震荡（37℃、200r/min、振幅30 mm，60min），弃悬浮细胞，培养基继续培养1d后，按上述方法再次进行震荡分离，得到纯化的星形胶质细胞。而原瓶细胞在加入0.1%胰酶37℃消化约15min，观察星形胶质细胞脱落后，弃去消化液，经清洗后加入胰酶消化液37℃消化5～10min得到小胶质细胞组分。两类细胞分别使用抗GFAP抗体，抗CD11b抗体检测纯度，其中星型胶质细胞占97%，小胶质细胞占＞95%。两类细胞以1×106个细胞密度接种6孔板继续培养24h，用于后续处理。（2）