RP-HPLC法同时测定不同产地墨旱莲中6个主要成分的含量

马利，易骏，吴建国，黄运喜，吴岩斌，吴锦忠

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建教育学院理科部，福建福州350025）

RP-HPLC法同时测定不同产地墨旱莲中6个主要成分的含量

马利1，易骏2，吴建国1，黄运喜1，吴岩斌1，吴锦忠1

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建教育学院理科部，福建福州350025）

目的建立同时测定不同产地墨旱莲药材中木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素6种化学成分的HPLC方法。方法采用YMC－Pack ODS－A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL／min，检测波长340 nm，柱温为25℃。结果在上述色谱条件下，木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素获良好分离，分别在5.5～21.1、6.3～50.3、17.9～71.4、3.8～37.8、4.9～39.4、0.7～5.3 μg／mL内线性关系良好，平均回收率分别为102.92%、98.44%、98.85%、100.91%、98.76%、101.94%。结论该方法稳定可靠、简便可行，可用于墨旱莲多种成分的同时定量分析。

HPLC；墨旱莲；产地；含量测定

墨旱莲是菊科鳢肠属植物鳢肠（Eclipta prostrata L.）的干燥地上部分，具有滋补肝肾、凉血止血的功效［1］，墨旱莲的化学成分主要有黄酮类、噻吩类、三萜皂苷类及香豆草醚类等成分［2］。目前2015年版《中国药典》对墨旱莲药材的质量控制指标仍仅限于蟛蜞菊内酯单一化学成分的含量测定［1］，很难全面反映墨旱莲药材整体的质量。旱莲中的黄酮类成分具有抗骨质疏松、抗氧化、抗肿瘤等多种药理学活性［3-5］，如木犀草素、木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素和蒙花苷是墨旱莲抗骨质疏松的主要生物活性成分之一［6］。因此，本实验建立了同时测定墨旱莲中5种黄酮类成分和蟛蜞菊内酯的HPLC含量测定方法，为全面控制墨旱莲药材的质量提供更加可靠的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器LC-20AT系列高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV检测器（日本岛津公司）；MS105DU电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DFT-200手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试药10批墨旱莲样品采自福建、广东、广西、浙江、江苏5个省份，经福建中医药大学中西医结合研究院吴锦忠教授鉴定为墨旱莲（Eclipta prostrata L.）。不同产地墨旱莲编号、采集样品地点和日期见表1。木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素为本实验室从墨旱莲中分离获得，纯度大于98%；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；甲醇为分析纯（上海化学试剂总公司）；乙醇为分析纯（上海化学试剂总公司）；超纯水为Milli-Q超纯水机制备（法国Millipore公司）。

表1 墨旱莲药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件YMC－Pack ODS－A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相组成为乙腈（A）-0.2%甲酸水（B），梯度洗脱：程序见表2；流速：1.0 mL／min；检测波长：340 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.2 混合对照品溶液的制备分别称取木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、芹菜素和蟛蜞菊内酯对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成对照品储备液，备用。

2.3 供试样品溶液的制备取70℃干燥恒重的墨旱莲药材粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80%乙醇50 mL，回流提取2 h，过滤，滤液50℃减压浓缩，用80%甲醇定容至25 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。混合对照品及供试品色谱图见图1。

图1 混合对照品及供试品HPLC色谱图

2.4 标准曲线及线性范围分别精密移取上述混合对照品溶液，加80%甲醇稀释，稀释成不同倍数，得一系列对照品混合溶液，摇匀。在上述色谱条件下进样分析，以各成分峰面积为纵坐标（y），质量浓度（μg／mL）为横坐标（x），绘制标准曲线，计算回归方程和线性范围，见表3。

表3 6个对照品的标准曲线

2.5 精密度实验精密吸取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算结果显示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素峰面积的RSD值分别为0.089%、0.144%、0.077%、0.492%、0.132%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验取同一批墨旱莲样品，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、12、24 h进行测定，结果显示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素的结果分别为0.691%、0.273%、0.373%、0.279%、0.179%和0.290%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性实验取同一批墨旱莲样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，记录峰面积。计算结果显示木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素的RSD值分别为2.65%、1.70%、1.52%、2.96%、0.97%和2.17%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验取已知含有量的样品（编号8），精密称取6份，分别精密加入一定量对照品，按“2.3”项下方法，制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。回收率结果显示：木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯和芹菜素的平均回收率分别为102.92%、98.44%、98.85%、100.91%、98.76%、101.94%，RSD分别为2.54%、1.93%、2.47%、1.49%、2.38%、1.06%、2.84%、2.29%，表明6个化合物的加样回收率良好。

2.9 样品含量的测定取不同产地的墨旱莲药材各1 g，以“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，按“2.1”项色谱条件下分析测定，每批样品测定3份，以平均值为测定结果，见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3）mg／g

3 讨论

采用本文建立的分析方法对10批不同产地墨旱莲药材进行了含量测定，结果表明：不同产地墨旱莲中6个主要成分的含量具有显著性差异，木犀草苷含量为0.177～2.346 mg／g，芹菜苷含量为0.168～1.125 mg／g，蒙花苷含量为0.924～9.880 mg／g，木犀草素含量为0.064～0.266 mg／g，蟛蜞菊内酯含量为0.792～10.542 mg／g，芹菜素含量为0.012～0.144 mg／g。蟛蜞菊内酯为香豆草醚类化合物，是墨旱莲最具特征的化学成分，为墨旱莲药材质量控制的指标性成分，2015年版《中国药典》［1］规定墨旱莲中蟛蜞菊内酯含量不得少于0.040%为测定标准。从表4中可以看出，所测样品中蟛蜞菊内酯的含量均符合药典规定，其中江苏宿迁所产墨旱莲中的蟛蜞菊内酯的量最高，广东揭阳所产墨旱莲中的蟛蜞菊内酯的量最低。墨旱莲中黄酮类化合物是其抗骨质疏松活性成分之一［6］，基于墨旱莲5种黄酮类成分含量差异，单纯以蟛蜞菊内酯的含有量来评价墨旱莲的质量是不够完整的，建议进行多指标成分的定量测定来控制墨旱莲及其制剂的内在质量。本研究为中国药典进行多指标成分控制墨旱莲质量提供了科学依据。

［1］国家典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：374-375.

［2］夏爱军，李玲，董昕，等.UHPLC-Q-TOF／MS技术应用于中药旱莲草化学成分研究［J］.解放军药学学报，2012，28（5）：404-407.

［3］黄运喜，易骏，吴建国，等.鳢肠不同部位抗骨质疏松活性及化学成分比较研究［J］.天然产物研究与开发，2014，26（8）：1229-1232，1298.

［4］王雪梅，张建胜，戴云，等.旱莲草总黄酮的提取及其体外抗氧化活性研究［J］.时珍国医国药，2009，20（2）：356-358.

［5］LIU Q M，ZHAO H Y，ZHONG X K，et al.Eclipta prostrata L. phytochemicals：isolation，structure elucidation，and their antitumor activity［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（11）：4016-4022.

［6］林雄浩，吴锦忠.中药复方二至丸的化学成分及抗骨质疏松研究进展［J］.解放军药学学报.2009，25（5）：421-424.

R284.2

A

1000-338X（2017）04-0060-03

2017-04-18

福建省科技厅引导性项目（2015Y0070、2014Y0049）

马利（1991—），女，2015级生药学专业硕士研究生，主要从事中药活性成分及品质评价研究。

吴岩斌（1982—），男，助理研究员。E-mail：wxsq1@163. com