乳腺癌细胞ret基因转录水平的表达及其与PI3KAktmTOR信号通路相关因子的关系

2017-09-12崔军威

实用临床医学 2017年6期

关键词：靶向试剂盒通路

杨满，崔军威，程苒，韦伟

(北京大学深圳医院乳甲外科，广东深圳 518036)

乳腺癌细胞ret基因转录水平的表达及其与PI3KAktmTOR信号通路相关因子的关系

杨满，崔军威，程苒，韦伟

(北京大学深圳医院乳甲外科，广东深圳 518036)

目的探讨乳腺癌细胞ret基因转录水平的表达及其与PI3KAktmTOR信号通路相关因子的关系。方法以乳腺癌细胞为研究对象，采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量，构建合成ret shRNA慢病毒载体，转染乳腺癌细胞，再次采用RT-PCR检测细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量。比较转染前后细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量，并采用Pearson线性相关分析法分析其细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量的关系。结果转染前细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量分别为0.851±0.126、0.872±0.126、0.845±0.087和0.769±0.355，均分别高于转染后的0.108±0.023、0.113±0.022、0.098±0.022和0.072±0.013(P<0.05)。Pearson线性相关分析结果显示，细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量均呈正相关(r=0.877、0.852、0.863,P<0.05)。结论乳腺癌细胞ret基因转录水平较高且与PI3KAktmTOR信号通路相关因子密切相关，可能通过调控PI3KAktmTOR信号通路而影响乳腺癌的发生发展，可能作为乳腺癌治疗的靶基因之一。

乳腺癌； ret基因； PI3KAktmTOR信号通路；关系

乳腺癌是常见恶性肿瘤疾病，其恶性程度高，病情进展快，患者预后情况差，急需改善[1-2]。近年来乳腺癌的诊治水平取得了较大进展，然而患者的预后情况仍不容乐观。因此，改善乳腺癌治疗效果是目前急需解决的医疗难题。近年来基因靶向治疗成为乳腺癌等癌症治疗的热门方向[3]。在癌症相关基因中，原癌基因RET发挥着重要作用，其过量表达与甲状腺癌等的发生发展密切相关[4]。因此，RET基因亦可能与乳腺癌发生发展相关。而乳腺癌的发生发展受到PI3KAktmTOR信号通路等的影响[5]。因此，本研究假设RET基因可能与乳腺癌PI3KAktmTOR信号通路相关，并进行了实验证实，将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 细胞来源

2015年9月至2016年6月于北京大学深圳医院行手术治疗的60例乳腺癌患者癌组织细胞，为新鲜组织，均经病理学检查诊断证实为原发性乳腺癌，腺癌21例，浸润性导管癌39例，年龄28～78(53.32±9.76)岁，PTNM分期为I期20例，Ⅱ期37例，Ⅲ期3例，无远处转移。实验经本院伦理学委员会审核批准，且相关患者均签署知情同意书。

1.2 实验时间和地点

于2015年9月至2016年6月在北京大学香港科技大学医学中心实验室完成。

1.3 试剂和仪器

恒温箱(江苏佳美仪器有限公司)，离心管、玻璃瓶、吸管、试管等(广东东普医疗科技有限公司)，离心机(德国艾本德公司)，DMEM/F12培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，逆转录试剂盒、cDNA合成试剂盒(美国Promega公司)，实时定量PCR试剂盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)，细胞培养箱、细胞培养板(美国SHELLAB公司)，荧光显微镜(日本Nikon公司)，离心管、玻璃瓶、吸管、试管等(广东东普医疗科技有限公司)，细胞培养箱、细胞培养板、医用恒温水浴箱(美国SHELLAB公司)，低温冰箱(青岛海尔公司)，引物(上海生物工程有限公司)，ABI PRISM 377测序仪(美国Perkin-Elmer公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

37 ℃水浴箱中使细胞融化，以3500 r·min-1转速离心5 min后弃去上清液，加入培养皿中培养，在37 ℃和5%CO2环境中培养，培养基为含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基，培养细胞至80%融合，采用0.25%的胰酶进行消化并按1：3～1：5的比率行传代培养，并取对数生长期细胞进行相关实验研究。

1.4.2 器具处理

所有实验器具均在使用前1 h行紫外线照射1 h，并在各器皿上贴上相应的标签以免实验操作中出现失误。

1.4.3 指标检测

采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量，常规提取总RNA，采用逆转录试剂盒行逆转录反应，按照试剂盒说明进引导进行操作，将cDNA冷藏于-20 ℃低温冰箱中备用。实行RT-PCR检测，操作亦按照相关试剂盒说明书进行，反应条件分别为先于94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃反应60 s，共进行40个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃反应5 min。进行3次独立重复检测。结果分析采用7500SDS v1.3.1软件操作，以18srRNA为内参，所得数据采用2-ΔΔCt公式进行分析。

1.4.4 含绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒颗粒构建

化学合成ret基因的shRNA序列(5′-CCTCGGTCCCAGCCTAAGGTCAAT-3′)，将实验合成的ret shRNA序列插入到GFP慢病毒颗粒中，构建ret shRNA慢病毒载体。

1.4.5 ret shRNA慢病毒载体转染

取对数生长期人乳腺癌细胞，显微镜下观察其生长情况并取生长状态良好的人乳腺癌细胞平铺在6孔板中，培养细胞至80%融合，各添加1 μL的ret shRNA慢病毒载体，3500 r·min-1和2 cm离心转染30 min，转染后培养1 d。

转染后培养1 d后再次行RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量的检测，具体检测方法同1.4.3。

1.5 统计学方法

采用SPSS19.0软件建立数据库并行统计学分析，其中计量资料均符合正态分布，采用两独立样本均数t检验进行比较，采用Pearson线性相关分析法分析其细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染前后的RET mRNA相对表达量比较

经核苷酸序列确定FAK shRNA序列成功插入GFP慢病毒颗粒，与转染前比较，转染后RET mRNA相对表达量明显降低，RET shRNA慢病毒载体可有效抑制RET mRNA表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 转染前后的PI3K、mTOR和 AKT mRNA相对表达量比较

与转染前比较，转染后PI3K、mTOR和 AKT mRNA相对表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

时间nRETmRNA相对表达量PI3KmRNA相对表达量mTORmRNA相对表达量AKTmRNA相对表达量转染前600.851±0.1260.872±0.1260.845±0.0870.769±0.055转染后600.108±0.0230.113±0.0220.098±0.0220.072±0.013t44.93145.96564.47995.530P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3 乳腺癌细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和 AKT mRNA表达量的关系分析

Pearson线性相关分析结果显示，细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和 AKT mRNA表达量均呈正相关(r=0.877、0.852、0.863,P<0.05)，见封四图1—3。

3 讨论

近年来随着生活方式、饮食结构和居住环境等的改变，各类癌症的发生不断增加。其中乳腺癌为临床常见癌症，是可严重威胁患者生命安全的恶性肿瘤疾病[6]。因此，对乳腺癌病情和预后的改善十分重要。乳腺癌的治疗方法多样，常采用的治疗方法有手术治疗、化疗、免疫治疗等，但各类治疗方法的预后情况仍较差[7]。改善乳腺癌疗效和预后的问题亟待解决。乳腺癌的发生发展涉及到原癌基因的活化以及抑癌基因的失活引发的相关蛋白合成障碍和细胞信号传导障碍，细胞生物学行为改变等[8]。RET基因为原癌基因，与乳腺癌密切相关[9]。而胡海燕[10]的毕业论文研究了青海地区乳腺癌、甲状腺多原发癌患者癌组织中RET基因的转录表达水平，其研究结果显示，青海地区乳腺癌、甲状腺多原发癌的癌组织中RET基因的转录表达水平较高，RET基因的过量表达与青海地区乳腺癌、甲状腺多原发癌的发生相关。因此，RET基因亦可能与乳腺癌发生发展相关。

乳腺癌的发生发展涉及多个信号通路，其中PI3KAktmTOR信号通路是乳腺癌细胞内信号传导的重要途径，其异常激活与乳腺癌的发生发展密切相关，可通过抑制肿瘤细胞的凋亡、促进肿瘤细胞生长、调节肿瘤细胞周期、促进肿瘤新生血管形成而促进侵袭转移等多种途径影响乳腺癌的发生发展以及临床转归，而抑制PI3KAktmTOR信号通路的活性对乳腺癌治疗具有重要意义[11-12]。近年来基因靶向治疗在乳腺癌的治疗研究较多[13]。本研究假设RET基因可能通过活化PI3KAktmTOR信号通路影响乳腺癌的发生发展，抑制RET基因可能抑制PI3KAktmTOR信号通路而达到抑制乳腺癌发展的目的。因此，本研究设计实验，以乳腺癌细胞为研究对象，构建合成病毒载体及RET ShRNA，转染乳腺癌细胞，采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测转染前后细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量，比较了转染前后细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量并分析了其细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量的关系，旨在为寻找乳腺癌基因靶向治疗的新的有效治疗基因提供依据。

本研究结果显示，ret shRNA慢病毒载体转染前乳腺癌细胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量均较高，均在0.79以上，提示RET基因和PI3KAktmTOR信号通路均与乳腺癌的发生相关。而ret shRNA慢病毒载体转染后的RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量明显降低，均降低到0.1左右，提示RET mRNA表达量可能与PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量有关。进一步的Pearson线性相关分析结果显示，随着乳腺癌细胞中RET mRNA表达量的增加，其PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量亦增加，乳腺癌细胞中RET mRNA表达量与其PI3K、mTOR和AKT mRNA表达量均呈正相关。RET与乳腺癌的发生发展密切相关，其在乳腺癌中的作用可能是通过激活PI3KAktmTOR信号通路而促进乳腺癌发生发展，而抑制RET基因的表达可抑制PI3KAktmTOR信号通路活性，抑制乳腺癌进一步发展，改善乳腺癌病情和预后。RET基因可能作为乳腺癌靶向治疗的靶基因之一，靶向抑制RET基因表达可能是乳腺癌治疗的有效方法之一

综上所述，乳腺癌细胞ret基因与乳腺癌发生发展和PI3KAktmTOR信号通路均相关，可能通过调控PI3KAktmTOR信号通路而影响乳腺癌发展，因此，靶向抑制RET基因表达可能作为乳腺癌靶向治疗的方法之一。

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(责任编辑：罗芳)