血必净注射液对严重脓毒症患者免疫调理机制的影响

康 健，周雯慧，沈景桂，周思佳，龚 平

(1.大连医科大学附属第一医院 急诊科，辽宁 大连116011；2.中南大学湘雅医学院 2013级临床医学专业，湖南 长沙 410013；3.郑州中心医院 重症医学科，河南 郑州 450000；4.辽宁省肿瘤医院 重症医学科，辽宁 沈阳 110042)

论 著

血必净注射液对严重脓毒症患者免疫调理机制的影响

康 健1，周雯慧2，沈景桂3，周思佳4，龚 平1

(1.大连医科大学附属第一医院 急诊科，辽宁 大连116011；2.中南大学湘雅医学院 2013级临床医学专业，湖南 长沙 410013；3.郑州中心医院 重症医学科，河南 郑州 450000；4.辽宁省肿瘤医院 重症医学科，辽宁 沈阳 110042)

目的 观察血必净注射液对严重脓毒症患者Th1细胞转录因子T-bet mRNA和Th2细胞转录因子GATA-3 mRNA表达的影响，探讨其能否通过影响Th1/Th2漂移来调理严重脓毒症患者的免疫紊乱。方法 将15例严重脓毒症患者分为血必净治疗组(n=9)和常规治疗组(n=6)。常规治疗组给予脓毒症的一般治疗，包括液体复苏、抗感染、必要时呼吸机辅助治疗以及营养支持等。血必净治疗组在相同的常规治疗基础上加用血必净注射液(100 mL，2次/d，应用7 d)。两组分别于入院当天(0 d)和入院后第1、3和7 天抽外周静脉血；应用Real-time RT-PCR检测T-bet和GATA-3 mRNAs；ELISA法检测血Th1分泌的IFN-γ和Th2分泌的IL-4；并同时进行APACHE II评分。结果 常规治疗组患者入院第3 天和第7 天的血IFN-γ、T-bet mRNA、T-bet/GATA-3、IFN-γ/IL-4均明显高于0 d(均P<0.05)，GATA-3 mRNA和IL-4明显低于0 d(均P<0.05)；血必净注射液治疗后第3 天和第7天患者的血IFN-γ、T-bet mRNA、T-bet /GATA-3、IFN-γ/IL-4明显低于常规治疗组(均P<0.05)，GATA-3 mRNA和IL-4明显高于常规治疗组(均P<0.05)。血必净注射液治疗后第7 天 APACHE II评分较常规治疗组显著下降(18.22±1.99 vs. 22.67±2.16，P=0.042)。结论 严重脓毒症患者存在Th1/Th2 失衡；血必净注射液能通过抑制T-bet mRNA表达和促进GATA-3 mRNA表达来改善Th1/Th2 失衡和缓解病情的严重程度。

脓毒症；血必净； T-bet ；GATA-3；IFN-γ；IL-4

脓毒症是指机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[1]，是临床上危重患者死亡的重要原因之一。多年来尽管对脓毒症的研究不断深入，但其发病机制仍不完全清楚。近年研究认为，脓毒症不单纯是病原体及其毒素导致的炎症损害，还存在免疫功能紊乱，主要表现为免疫抑制，其中T淋巴细胞亚群变化是引起脓毒症免疫功能紊乱的关键因素[2-3]。CD4+T淋巴细胞被病原微生物激活后可分化为Th0细胞，而Th0细胞依据其分泌细胞因子的不同可分为Th1和Th2两个亚群[4]。Th1通过分泌IL-2、IL-12、INF-γ等促炎细胞因子，介导细胞免疫应答；Th2通过分泌IL-4、IL-5、IL-10等抗炎细胞因子，介导体液免疫应答并与免疫抑制相关[4-5]。T-bet和GATA-3分别是Th1和Th2特异性转录因子[6-8]。正常状态下，体内Th1和Th2功能处于动态平衡，维持正常的细胞和体液免疫应答；Th1向Th2分化的漂移是脓毒症产生免疫抑制的主要机制之一[4]。血必净注射液在我国已广泛应用于脓毒症患者的治疗[9-11]。研究表明，血必净注射液具有改善脓毒症患者炎症、免疫和凝血等功能[12-13]，但其对Th1/Th2漂移及其上游调控机制的影响尚未见研究。本研究拟观察血必净注射液对严重脓毒症患者T-bet和GATA-3 mRNAs表达的影响，探讨其能否通过影响Th1/Th2漂移来调理脓毒症患者的免疫紊乱。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年6月至2014年12月大连医科大学附属第一医院急诊ICU就诊的严重脓毒症患者15例，其中男10例，女5例，年龄(59.3±13.9)岁。严重脓毒症诊断标准参照2001年美国胸科医师协会/美国危重病学会联合会议通过的相关定义及诊断标准[14]。排除患有HIV、血液系统疾病、肿瘤、长期服用激素、免疫抑制剂等严重影响免疫功能的药物以及其它严重影响患者免疫功能及生存的疾病的患者。

1.2 分组及治疗方法

本研究经大连医科大学附属第一医院伦理委员会批准，且本人或家属签署知情同意书。根据治疗方法不同将患者分为血必净治疗组(n=9)和常规治疗组 (n=6)。两组患者在性别、年龄和入院当天(0 d) APPACHE II评分的差异均无统计学意义(均P>0.05，见表1)。

表1 两组患者的一般资料

两组患者入院当天开始均给予脓毒症的一般治疗，包括液体复苏、抗感染、必要时呼吸机辅助治疗以及营养支持等。血必净治疗组在入院当天开始给予血必净注射液(红日药业集团，天津)100 mL加0.9%氯化钠 100 mL静脉滴注，2次/d，应用7 d；常规治疗组给予等量的0.9%氯化钠静脉滴注。

1.3 检测指标

两组患者分别于入院当天(0 d)和入院后第1、3和7 天各抽取外周血4 mL，其中2 mL置于EDTA管中用于淋巴细胞分离并检测T-bet和GATA-3 mRNAs，另2 mL置于促凝管中用于检测血IFN-γ和IL-4。并同时进行APACHE II评分。

1.3.1 Real-time RT-PCR检测T-bet和GATA-3 mRNAs

采血后2 h内用人淋巴细胞分离液(索莱宝公司，北京)提取淋巴细胞，置于-80 ℃冰箱冻存备用。按TRIzol(TaKaRa)试剂说明书从分离的淋巴细胞中提取总RNA，于-80 ℃冰箱中保存备用。将各个样品总RNA稀释至相同浓度，使用Prime Script RT PCR Kit试剂盒(宝生物公司，大连)按50 μL的反应体系制备cDNA，具体操作按试剂盒说明书进行。T-bet引物大小为 118 bp，上游引物：5'-ACAAACCCGATATGGCTGAGA-3'；下游引物:5'-CCTGCTTGCTTCTCCT GTTC-3'；GATA-3 引物大小为240 bp，上游引物为5'-TGCGGGCTCTACCACAAAAT-3'，下游引物为5'-TCGGTTTCTGGTCTGGATGC-3'；内参基因GAPDH引物大小为238 bp，上游引物为5'-CCATCACTGCCACTCAGAAGACT-3'，下游引物为5'-GTCAGATCCACAACGGATACATTG-3'。然后采用Quant script RT Kit(天根生化科技有限公司，北京)进行Real-time RT-PCR分析，以2-ΔΔCt法计算，所测基因的循环时间(Ct) 用GAPDH标准化。每个样本测3次。

1.3.2 ELISA法检测血IFN-γ和IL-4

采用ELISA法检测外周血IFN-γ和IL-4(RD公司，美国)，具体操作按说明书进行。每个样本测3次。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 两组患者T-bet和GATA-3 mRNAs的比较

常规治疗组第3和7 天患者的T-bet mRNA及T-bet /GATA-3均明显高于0 d(均P<0.05)，GATA-3 mRNA明显低于0 d(P<0.05)；而跟常规治疗组相比，血必净注射液治疗后第3和7 天患者的T-bet mRNA及T-bet /GATA-3明显降低(均P<0.05)，GATA-3 mRNA明显升高(P<0.05)。见表2。

2.2 两组患者血IFN-γ和IL-4的比较

常规治疗组入院第3和7天患者的血IFN-γ和IFN-γ/IL-4均明显高于0 d(均P<0.05)，血IL-4明显低于0 d(P<0.05)；跟常规治疗组相比，血必净注射液治疗后第3和7 天患者的血IFN-γ和IFN-γ/IL-4明显降低(均P<0.05)，血IL-4明显升高(P<0.05)。见表3。

表2 两组患者不同时间点T-bet 和GATA-3 mRNA及T-bet /GATA-3的比较

Tab 2 Comparison of T-bet and GATA-3 mRNAs and T-bet/GATA-3 of patients at different time points in the two groups

项目常规治疗组(n=6)血必净治疗组(n=9)T-betmRNA 0d1.03±0.161.04±0.24 1d1.31±0.171.29±0.14 3d2.35±0.211)1.49±0.192) 7d2.40±0.261)1.10±0.212)GATA-3mRNA 0d1.34±0.341.22±0.24 1d1.39±0.241.25±0.13 3d0.92±0.141)1.02±0.222) 7d0.81±0.181)1.15±0.122)T-bet/GATA-3 0d0.77±0.140.85±0.14 1d0.94±0.131.03±0.17 3d2.55±0.711)1.46±0.152) 7d2.96±0.911)0.96±0.202)

1)与0 d比较，P<0.05；2)与常规治疗组比较，P<0.05

表3 两组患者不同时间点血IFN-γ和IL-4及IFN-γ/IL-4的比较

Tab 3 Comparison of blood IFN-γ, IL-4 and IFN-γ/IL-4 of patients at different time points in the two groups

项目常规治疗组(n=6)血必净治疗组(n=9)IFN-γ(ng/L) 0d165.8±22.8170.1±23.0 1d176.6±31.8173.9±36.7 3d314.7±22.91)281.6±49.22) 7d329.4±66.81)280.6±59.22)IL-4(ng/L) 0d243.5±1.9245.3±1.7 1d238.4±3.2241.2±3.4 3d216.2±3.61)235.3±3.02) 7d205.8±1.51)234.9±1.72)IFN-γ/IL-4 0d 0.7±0.2 0.7±0.1 1d 0.7±0.2 0.7±0.1 3d 1.5±0.21) 1.2±0.92) 7d 1.6±0.31) 1.2±2.82)

1)与0 d比较，P<0.05；2)与常规治疗组比较，P<0.05

2.3 两组患者APACHE II评分的比较

血必净注射液治疗后第7 天 APACHE II评分较常规治疗组显著下降(18.22±1.99 vs. 22.67±2.16，P=0.042)，而在治疗后第1和3天两组APACHE II评分之间的差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨 论

本研究发现，严重脓毒症患者外周血促炎介质IFN-γ、Th1细胞转录因子T-bet mRNA、Th1和Th2细胞转录因子的比值(T-bet/GATA-3)、促炎介质IFN-γ和抑炎介质IL-4的比值(IFN-γ/IL-4)均升高，GATA-3 mRNA和IL-4均降低；而血必净注射液治疗能显著降低患者血IFN-γ、T-bet mRNA、T-bet /GATA-3、IFN-γ/IL-4，升高GATA-3 mRNA和IL-4，并改善患者的APACHE II评分。

研究证明，脓毒症发病中炎症反应贯穿始终，同时存在免疫系统失衡，这是导致其预后不佳的主要原因之一[2,5,15]。因此，脓毒症治疗中抗炎治疗与免疫调理越来越受到关注。Th1和Th2细胞调控着机体复杂的细胞因子网络，可在整体水平上评估脓毒症患者的免疫功能，当向Th2细胞漂移时，机体将出现免疫抑制[4-5,15]。IFN-γ和IL-4分别作为Th1和Th2细胞分泌的细胞因子，其本身也在调节Th1和Th2细胞分化中起重要作用[15]。IFN-γ具有促进Th1细胞的分化和抑制Th2细胞分化的作用[2]；而IL-4则具有促进Th2细胞的分化和抑制Th1细胞分化的作用[3,8]。本研究中观察到常规治疗组患者促炎介质IFN-γ和抑炎介质IL-4及其比值(IFN-γ/IL-4)均升高，提示严重脓毒症患者的促炎和抑炎反应都升高，但总体上是促炎反应占优势，即存在亢进的全身炎症反应综合征(SIRS)。

T-bet和GATA-3分别作为Th1和Th2细胞特异性转录因子在调节这两类细胞分化中起重要作用[6-7,15]。T-bet能促进Th1细胞分化和INF-γ分泌增加；GATA-3在调节Th2细胞分化中起重要作用，可通过抑制T-bet和INF-γ基因的表达来实现Th1向Th2细胞的漂移，同时也可通过激活IL-4基因的表达来促进Th2细胞的分化[8,15]。另外，T-bet和GATA-3的表达量与Th1和Th2细胞数量呈正相关[15]。本研究观察到常规治疗组患者T-bet和GATA-3 mRNAs表达的变化趋势与Th1和Th2的变化趋势(即IFN-γ和IL-4)是一致的，验证了T-bet和GATA-3在Th1和Th2细胞分化中的重要调节作用。

血必净注射液的主要化学成分有红花、丹参、川芎、赤芍和当归五味中药，已有许多研究证实其具有改善脓毒症患者炎症反应作用，但其具体机制不完全清楚[9-13]。本研究结果显示，经过血必净注射液治疗后严重脓毒症患者血Th1的 T-bet mRNA表达及其分泌的促炎介质IFN-γ均下降，同时血Th2的 GATA-3 mRNA表达及其分泌的抑炎介质IL-4均升高，这提示血必净注射液能通过影响Th1和 Th2细胞转录因子的表达来抑制严重脓毒症患者的炎症反应，这可能是血必净注射液改善脓毒症患者炎症反应的作用机制之一。APACHE II评分，即急性生理与慢性健康评分，因其具有能简便和可靠地评估病情严重程度的特点而已成为目前世界范围内ICU普遍使用的评分系统。本研究中，经血必净注射液治疗的严重脓毒症患者APACHE II评分降低，提示血必净注射液能改善患者发病的严重程度，这可能与血必净注射液对Th1和 Th2细胞转录因子表达的上述影响有关。然而，脓毒症患者出现Th1和Th2细胞的漂移是多因素作用的结果，除细胞因子和转录因子的原因外，Treg细胞活性、调节性树突状细胞的功能改变均可对Th1和Th2细胞之间的漂移产生影响[16]。一项有关血必净注射液治疗脓毒症的动物实验表明其可通过促进Treg细胞的凋亡来影响Th1和Th2细胞的分化[17]。另外一项研究也显示出血必净注射液可以通过抑制调节性树突状细胞的功能来改善Th1细胞向Th2细胞的漂移[12]。这些研究提示，血必净注射液影响Th1细胞和Th2细胞之间漂移的机制很复杂，还需要进一步研究。

总之，严重脓毒症患者存在Th1/Th2 失衡；血必净注射液能通过抑制T-bet mRNA表达和促进GATA-3 mRNA表达来改善促炎/抗炎反应的失衡，起到免疫调理的作用，达到改善病情严重程度的效果。这也启示我们可利用中药改善患者的免疫功能来提高脓毒症患者的生存率的可能性，然而遗憾的是本研究纳入病例偏少，尚需继续扩大样本量，对血必净注射液影响脓毒症患者的免疫调理作用及机制进行深一步的探讨。

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Effect of Xuebijing injection on immune regulation in patients with severe sepsis

KANG Jian1, ZHOU Wenhui2,SHEN Jinggui3, ZHOU Sijia4, GONG Ping1

(1.Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011,China; 2.Undergraduate Student of Clinical Medicine Enrolled in 2013, Xiangya Medical College of Central South University, Changsha 410013,China; 3.Department of Intensive Care Medicine, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou 450000, China; 4.Intensive Care Medicine, Liaoning Cancer Hospital, Shenyang 110042,China)

Objective To observe the effect of Xuebijing injection on the expressions of Th1 lymphocyte transcription factor T-bet mRNA and Th2 lymphocyte transcription factor GATA-3 mRNA and thus investigate its possible mechanism of immune regulation by affecting Th1/Th2 shift in patients with severe sepsis. Methods Fifteen severe septic patients were randomly divided into Xuebijing treatment group (n=9) and conventional therapy group (n=6). The patients in the conventional therapy group

the conventional treatments for sepsis, including fluid resuscitation, antibiotic therapy, mechanical ventilation if necessary, nutrient support and so on. Based on the same treatment as conventional therapy group, the patients in the Xuebijing treatment group received Xuebijing treatment (100 mL, twice, for 7 days). Peripheral venous blood was drawn from the patients in the two groups on admission and days 1,3 and 7, the expressions of T-bet and GATA-3 mRNAs were tested by Real-time RT-PCR,blood IFN-γ secreted by Th1 and IL-4 secreted by Th2 were tested by ELISA, meanwhile APACHE II scores were assessed. Results The patients in the conventional therapy group showed higher blood levels of IFN-γ, T-bet mRNA, T-bet /GATA-3 and IFN-γ/IL-4 on days 3 and 7 and lower levels of GATA-3 mRNA and IL-4 compared with those on day 0 (allP<0.05). The patients in the Xuebijing treatment group had the decreased blood levels of IFN-γ, T-bet mRNA, T-bet /GATA-3 and IFN-γ/IL-4 and the increased blood levels of GATA-3 mRNA and IL-4 compared with the patients in the conventional therapy group on days 3 and 7 (allP<0.05). The APACHE II scores were significantly decreased in the Xuebijing treatment group compared with the conventional therapy group on day 7 (18.22±1.99 vs. 22.67±2.16,P=0.042). Conclusions Patients with severe sepsis has an imbalance of Th1/Th2. Xuebijing injection improves the imbalance of Th1/Th2 and the severity of sepsis by inhibiting the expression of T-bet mRNA and improving the expression of GATA-3mRNA.

sepsis; Xuebijing; T-bet; GATA-3; IFN-γ; IL-4

国家自然科学基金项目(81571869)；辽宁省自然科学基金项目(201403858)

康 健(1968-)，女，主任医师。E-mail: kangjian2014@sina.com

龚 平，主任医师。E-mail: gongp828@sina.cn

10.11724/jdmu.2017.04.04

R459.7

A

1671-7295(2017)04-0329-05

康健，周雯慧，沈景桂，等.血必净注射液对严重脓毒症患者免疫调理机制的影响[J].大连医科大学学报，2017,39(4)：329-333.

2017-06-12；

2017-06-28)