比索洛尔联合大黄灌服对大鼠血压昼夜节律及心肌组织内皮系统的影响

于立杰 肖荷妹 李凤丹 雷新锋 李炳茂

·论著·

比索洛尔联合大黄灌服对大鼠血压昼夜节律及心肌组织内皮系统的影响

于立杰 肖荷妹 李凤丹 雷新锋 李炳茂

目的观察比索洛尔联用中药大黄治疗前后大鼠血压、一氧化氮(NO)和内皮素(ET)的时间生物学特征的变化。方法健康雄性SD大鼠96只，随机分为组Ⅰ(对照组，给予安慰剂)、组Ⅱ(灌服比索洛尔组，3 mg·kg-1·d-1)和组Ⅲ(300 mg·kg-1·d-1)，每组32只。每大组又随机分为4小组，每组8只。服药前1 d，分别于同日内不同时间点(02∶00，08∶00，14∶00，20∶00)用鼠尾血压仪测各大组中各一小组大鼠收缩压。4周后，分别于同日内不同时间点(02∶00，08∶00，14∶00，20∶00)用鼠尾血压仪测各大组中各一小组大鼠收缩压并处死，留取心肌组织，匀浆后取上清液，分别采用放免法和硝酸还原法检测血中ET-1、NO的水平。结果与组Ⅰ比较，组Ⅱ、组Ⅲ在服药4周后，收缩压均下降，心肌组织内ET-1浓度降低，心肌组织NO明显上升，与组Ⅰ比较差异均有统计学意义(P<0.05)。经治疗后组Ⅲ的血压较组Ⅱ下降更明显，差异有统计学意义(P<0.05)，组Ⅲ的心肌组织ET-1浓度较组Ⅱ低，差异有统计学意义(P<0.05)，组Ⅲ的心肌组织NO较组Ⅱ上升更显著，差异有统计学意义(P<0.05)。余弦拟合曲线的特征值分析：组Ⅱ、组Ⅲ治疗后收缩压中值、心肌组织中ET-1曲线的中值较组Ⅰ减小，心肌组织中NO曲线的中值较组Ⅰ增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，但组Ⅱ各指标的变化幅度较组Ⅲ小，差异有统计学意义(P<0.05)。组Ⅱ、组Ⅲ大鼠治疗后收缩压、心肌组织ET-1和NO曲线的振幅、峰值相位、峰值时间均发生不同程度的位移(P<0.05)。结论比索洛尔联合大黄具有协同作用，能更明显降低血压，同时对于维持血压昼夜节律、改善组织内皮系统功能有明显影响。

昼夜节律；比索洛尔；大黄；内皮素；一氧化氮

研究表明，正常情况下人体血压昼夜节律呈“双峰一谷”的“长柄杓型”,即清晨觉醒前后，血压持续上升，9∶00～11∶00达到高峰，然后逐渐平稳，并于15∶00～18∶00再次出现高峰，晚上睡眠后血压持续下降，2∶00～3∶00时最低，清晨睡醒前血压又缓慢上升，全天出现“双峰一谷”的长柄杓型曲线[1]。通常规定根据夜间平均血压较日间平均血压下降的比率[(日间血压平均值- 夜间血压平均值)/日间血压平均值×100%]分为四种类型：(1)夜间血压平均值较日间血压平均值下降的比率在10%～20%，称之为杓型血压(dipper)，这种血压类型相对比较健康；(2)夜间血压较日间下降的比率小于10%且大于0，称之为非杓型血压(non-dippers)；(3)夜间血压下降值大于日间20%，称之为超杓型或深杓型(over-dippers 或extreme-dippers)；(4)夜间血压均值高于白天血压均值，为反杓型(reverse-dippers)。后三种类型均为异常的血压节律。异常的血压昼夜节律是高血压多种合并症的独立危险因素，与心、脑、肾等靶器官损害密切相关[2-4]，对于血压正常患者，如果其血压昼夜节律消失，此类患者的心血管疾病病死率与杓型原发性高血压也是相同的[5]。夜间血压水平持续升高和昼夜节律减弱或消失，使心血管系统长时间处于负荷状态，以致更容易发生左心室肥厚，更大程度的改变心脏结构和心脏异常状态[6,7]。血压昼夜节律受内皮系统活性物质如舒张血管物质一氧化氮(NO)和缩血管物质内皮素(ET)的调控，生理状态下，二者处于平衡状态，但当血管内皮功能受损时，血浆中内皮素升高，二者平衡被打破，其昼夜节律消失，导致血压昼夜节律消失[8,9]。目前中医学对血压昼夜节律异常的病因病机研究主要集中在三个方面，即用阴阳学说来阐释血压昼夜节律的变化；用中医辨证的方法探讨不同中医症型与血压昼夜节律异常的关系；运用子午流注理论来探究血压昼夜节律紊乱的机制[2]。近年来中医药在降低高血压、恢复血压节律方面的应用即是基于中医辨证思维的原理，祖国传统医药博大精深，以其毒副作用小、多靶点发挥疗效等优点在临床上逐渐受到重视。但对于中药的降低血压、改善血压昼夜节律及其对靶器官保护的分子学机制还有待进一步研究，为此我们选取大鼠为研究对象，并以血压和心肌组织为研究靶点，比较比索洛尔联合大黄与单用比索洛尔治疗前后血压、心肌组织NO活性和ET-1浓度的变化，为探讨中西药物联合治疗高血压、改善组织内皮功能、减轻靶器官损害的影响提供理论基础，也为新兴药物选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 自河北医科大学实验动物中心购买健康雄性清洁级10周龄SD大鼠96只，体重250～300 g，常规饲养于衡水市人民医院动物中心，室温维持在(22±2)℃，保持动物自由进食。给予适应性饲养1周后，将上述96只清洁级SD大鼠随机分为组Ⅰ(对照组，给予安慰剂)、组Ⅱ(灌服比索洛尔组，3 mg·kg-1·d-1)及组Ⅲ(灌服比索洛尔，3 mg·kg-1·d-1)和(大黄组，300 mg·kg-1·d-1)，每大组又随机分为4个小组，每组8只。

1.2 方法

1.2.1 动物血压的测定:采用RBP-1B型光电法鼠尾测定仪(中日友好医院生产)测定所有大鼠收缩压，于灌胃前1 d及灌胃4周后的最后1 d的不同时间点，即02∶00，08∶00，14∶00，20∶00，分别测量3大组中各一小组大鼠的收缩压。

1.2.2 取材:每日晨起7∶00，组Ⅱ给予比索洛尔(北京华素制药股份有限公司)3 mg·kg-1·d-1灌胃1次，组Ⅲ分别给予比索洛尔3 mg·kg-1·d-1和大黄300 mg·kg-1·d-1灌胃1次，对照组给予相应剂量的安慰剂(清水)，持续灌服上述药物及安慰剂4周后，分别于同日24 h内的02∶00，08∶00，14∶00，20∶00，不同时间点处死三大组中的各一小组大鼠，留取心肌组织，匀浆后低温离心，3 000 r/min，留取上清液，-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 指标的测定:自南京建成生物工程研究所购买NO试剂盒。 采用硝酸还原酶法测定NO的浓度。自解放军总医院科技开发中心放免研究所购买ET-1测定试剂盒。采用放免法测定ET-1浓度。

2 结果

2.1 3组各指标比较 与组Ⅰ比较，组Ⅱ、组Ⅲ在服药4周后，收缩压均下降，心肌组织内ET-1浓度降低，心肌组织NO明显上升，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 组Ⅱ、组Ⅲ各指标比较 经治疗后组Ⅲ的血压较组Ⅱ下降更明显，差异有统计学意义(P<0.05)，组Ⅲ的心肌组织ET-1浓度较组Ⅱ低，差异有统计学意义(P<0.05)，组Ⅲ的心肌组织NO较组Ⅱ上升更显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 收缩压、心肌组织ET-1和NO的余弦拟合曲线特征值比较 应用最小二乘法原理对三组大鼠服药前后收缩压、心肌组织ET-1和NO进行余弦拟合法分析，得出余弦拟合曲线的特征值，对各曲线的特征值分析可见，灌服比索洛尔组、灌服比索洛尔和大黄组大鼠治疗后收缩压中值较对照组大鼠的血压中值减小，差异有统计学意义(P<0.05)，灌服比索洛尔组、灌服比索洛尔和大黄组大鼠心肌组织ET-1曲线的中值较对照组大鼠心肌组织中ET-1曲线的中值减小，差异有统计学意义(P<0.05)，灌服比索洛尔组、灌服比索洛尔和大黄组心肌组织NO曲线的中值较对照组大鼠心肌组织中NO曲线的中值增加，差异有统计学意义(P<0.05)，但灌服比索洛尔组各指标的变化幅度较灌服比索洛尔和大黄组小。2治疗组大鼠治疗后收缩压、心肌组织ET-1和NO曲线的振幅、峰值相位、峰值时间均发生不同程度的位移(P<0.05)。见表2，图1～3。

表1 3组大鼠治疗前后不同时段各指标的检测结果

注：与组Ⅰ比较，*P<0.05；与组Ⅱ比较，#P<0.05

表2 3组大鼠治疗前后各指标的生物节律的特征变化

图1 3组大鼠血压的余弦拟合曲线比较

3 讨论

图2 3组大鼠心肌组织NO的余弦拟合曲线比较

人体血压的正常节律为杓型，非杓型、反杓型、超杓型血压节律均为异常节律。研究已证实，血压昼夜节律是独立于血压水平之外的心脑血管病预测因素[5]。非杓型血压是左心室肥厚(LVH)、脑血管疾病、充血性心力衰竭、心肌梗死、蛋白尿的独立危险因素[10]，较杓型血压相比，更能加速颈动脉粥样硬化进程和促进颈动脉内膜中层厚度增加[11,12]。超杓型和反杓型患者中脑血管损害更常见，尤其是反杓型，卒中发生率最高[13]。寇惠娟等[14]纳入349例原发性高血压患者，其中LVH高血压患者74例，非LVH高血压患者275例，二者夜间血压下降率差异有统计学意义，进一步分层分析发现，杓型组、超杓型组、非杓型组、反杓型组患者左心室重量指数(left ventricular mass index，LVMI)差异有统计学意义(P<0.05)，其中，反杓型组患者的LVMI显著高于杓型组和非杓型组，非杓型组患者显著高于杓型组患者。多因素相关分析结果提示夜间血压下降率与LVMI呈显著负相关。田俊萍等[15]分析探讨了糖尿病和非糖尿病的缺血性卒中患者的血压昼夜节律与心脑血管预后的关系，研究发现，在非糖尿病组，未观察到血压昼夜模式与预后的相关性，但在糖尿病组，分析显示非杓型患者无心脑血管事件的生存显著低于杓型患者，Cox回归显示高龄、糖尿病、高的入院改良Rankin评分法评分、收缩压夜间血压下降率(非杓型)是卒中患者不良心脑血管事件的预测因素。结果显示血压昼夜节律异常是糖尿病的缺血性卒中患者不良心脑血管预后的预测因素，而在非糖尿病的卒中患者却未发现血压昼夜节律与预后的相关性。还有研究发现，与杓型高血压患者相比较，非杓型和反杓型高血压患者早期肾损害的指标如肾小球滤过率(eGFR)、尿微量白蛋白(MA)、胱抑素C均异常升高，提示血压昼夜节律减弱或消失与早期肾损害密切相关[16]。本研究发现，治疗组大鼠心肌组织中ET、NO较对照组有变化，提示导致血压昼夜节律异常的内皮系统活性物质也作用于动物组织，提示内皮系统—血压昼夜节律—组织损伤三者可能存在关联。

图3 3组大鼠心肌组织ET-1浓度余弦拟合曲线比较

近年来研究证实，血压昼夜节律的调控机制可能有以下几个方面：神经因素、体液因素和活动、睡眠因素等，另外，体内一些激素及一些疾病状态也影响着患者的血压节律[17,18]，其中体液因素包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS)和血管内皮系统[6]。血管内皮细胞主要产生两大类血管活性物质：内皮依赖性舒张因子和内皮依赖性收缩因子，其中，血管舒张因子NO和ET是维持血管基础张力的血管活性物质，生理情况下，二者处于平衡状态，维持人体正常的血压昼夜节律。当内皮细胞损伤后，体内ET-1/NO的自身调节体系平衡被破坏[19]，具有强力缩血管作用的物质如ET-1、血栓素(TXA2)释放增加，而NO、前列环素(PGⅠ2)等扩血管作用物质分泌减少，导致血管内皮收缩功能增强，依赖性舒张功能减弱，血管壁结构发生变化，导致血压升高。而血管内皮受损导致血管通透性增加，大分子物质如低密度脂蛋白、胰岛素以及各种细胞生长因子进入血管壁，使得全身血管粥样硬化逐渐形成，进一步造成相应灌注器官的受损。在高血压时存在着靶器官损害-ET释放增多-血压昼夜节律消失三者之间的恶性循环[9]。任智超等[8]的研究也佐证了上述理论，研究发现，血浆中内皮微粒水平随着血压变异性的增大而升高，而血压变异性的改变可以体现在血压晨峰的有无、昼夜节律的改变等方面。血压晨峰的有无与血浆中内皮微粒和ET水平呈正相关，提示血压晨峰的出现将导致内皮功能的严重受损，从而导致内皮细胞大量释放内皮微粒和ET，且内皮细胞的受损程度与高血压的严重程度成正相关，随着收缩压或舒张压的不断增高，内皮细胞受损越严重。本研究发现，治疗组较对照组心肌组织中NO含量增高，ET含量减少，且治疗组血压水平比对照组低，可以反推血压水平及节律变化与内皮系统有关联。

比索洛尔是一种高度选择性β1受体阻滞剂，可抑制肾素的基础分泌和刺激后分泌，升高NO浓度，降低ET-1浓度，通过改善血管内皮功能，进而有效降低血压并减少其对靶器官的损害[20]。但对β-受体阻滞剂对于组织内皮影响还未见报道，本研究结果发现两治疗组大鼠在治疗后，血压降低同时，NO上升，ET-1浓度下降，且血压、NO、ET-1的生物学特征明显改变，表现为中值、振幅下降，峰值相位、峰值时间变化明显。表明比索洛尔在降低血压同时，可以明显改善组织内皮功能，提示比索洛尔可能会改善组织器官损伤。

近年来，通过传统中医疗法控制血压，减少药物不良反应，恢复异常的血压昼夜节律，减少靶器官的损害[2，21]。中医药的降压机制是多方面的，通过多途径、多环节、多靶点发挥降压作用，并能兼顾高血压的其他病理环节。近年来，利用中医药来协助西药降压治疗，调节异常血压节律，取得了明显效果[22,23]。传统中药大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄与药用大黄的干燥根茎。性味苦、寒。入脾、胃、大肠、心包、肝经。主要功效为泻下通便，清热解毒，活血化瘀等。早在1992年，李炳茂[24]就发现了大黄的降压、降糖作用，并将之应用于临床，取得了明显效果。现代药理研究表明，大黄具有泻下、抑菌、抗肿瘤、双向调节血压、抑制血小板聚集、一直肝脏过氧化脂质的生成、抗衰老、抗病毒、清除氧自由基、抗肝纤维化、增强免疫力等作用[25]。大黄在心血管系统的作用体现在可以降压、强心、降血脂、改善微循环。其机制可能是大黄抑制去氧肾上腺素对血管的收缩反应；大黄还能抑制组胺诱导的血管收缩反应；大黄是钙通道阻滞剂；大黄中含有大黄素、大黄蒽醌衍生物，其中大黄素有利尿排尿的效果，大黄蒽醌衍生物对高血压发病过程中重要的血管紧张素转化酶有明显的抑制作用，降低血压；大黄对血管内皮和肺泡上皮具有保护作用[26-28]。本研究发现大黄联合比索洛尔组大鼠治疗后与比索洛尔组相比较，血压、心肌组织ET-1浓度下降幅度更大，心肌组织NO含量更高，且各指标曲线提示曲线各值变化更明显，表明联合大黄治疗对组织内皮具有更好的保护作用，能够更平稳的降低血压，维持血压正常的生物节律。

本研究采用正常血压大鼠进行研究，便于取材，也避免了高血压对NO、ET等活性物质水平的影响，利于更直接的观察指标变化，大鼠是夜间活动动物，在喂饲大鼠过程中，尽量避免光照等外界条件对其造成的干扰，尽量保持其应原本的活动规律，采用一次喂饲药物，也更好的模拟了目前常用的一次给药方法。本研究还有很多不足之处，如所选取动物数量偏少，不能完全模拟人体的组织中活性物质变化过程等，在今后的研究中，更加完善研究方法，加大样本数量，采用更加科学、合理等实验环境等。传统中医药在我国广大人民群众中有良好的应用基础，且相对于西药来说可能价格更便宜，患者应用依从性更好，应充分挖掘大黄的临床利用价值，提取、提纯其有效成分，以更方便患者应用。

1 鲁晓春.血压晨峰现象.中华老年心脑血管病杂志,2013,15:895-896.

2 高雪,李侠.中医对血压昼夜节律异常的认识.中医杂志,2016,57:1798-1800.

3 Tai C,Sun Y,Dai N,et al.Prognostic significance of visit-to-visit systolic blood pressure variability:a meta-analysis of 77299 patients.J Clin Hypertens(Greenwich),2015,17:107-115.

4 Rekhviashvili A,Giorgobiani T,Minashvili A,et al.Influence of circadian blood pressure profile on endothelial function in patients with and without artetial hypertension.Georgian Med News,2015,240:29-32.

5 Ohkubo T,Hozawa A,Yamaguchi J,et al.Prognosis significance of the nocturnal decline in blood pressure in indiduals with and without hight 24-h blood pressure:the Ohasama study.J Hypertens,2002,20:2183-2218.

6 杨趁,刘健,王舒.高血压患者血压昼夜节律对左心室肥厚的影响及其机制.辽宁中医杂志,2014,41:1141-1143.

7 Cuspidi C,Meani S,Salerno M,et al.Cardiovascular target organ damage in essential hypertensive with or without reproducible noctumal fall in blood pressure.J Hypertens,2004,22:273-280.

8 任智超,张子新,李烨,等.原发性高血压患者血压变异性、昼夜节律与内皮微粒水平的相关性.中华高血压杂志,2015,23:1045-1052.

9 于立杰,郭艺芳.血管内皮源性活性物质对血压昼夜节律的影响.中国医药导刊，2008,10:182-183，187.

10 Kulah E,Dursun A,Aktunc E,et al.Effects of angiotensinconverting enzyme gene polymorphism and serum vitamin D levels on ambulatory blood pressure measurement and left ventricular mass in Turkish hypertensive population.Blood Press Monit,2007,12:207-213.

11 杨梅,殷华,黄晓晖.血压昼夜节律与颈动脉内膜中膜厚度的关系.中国医药指南,2011,9:235-237.

12 周隽,于宠,王玮,等.血压昼夜节律对颈动脉粥样硬化的影响.中国医药指南,2011,10:24-25.

13 Kario K,Pickering TG,Matsuo T,et al.Stroke prognosisand abnormal nocturnal blood pressure falls in older hyper-tensives.Hypertension,2001,38:852-857.

14 寇惠娟,汪鑫,高登峰,等.高血压患者血压昼夜节律、B型脑钠肽与左心室肥厚的关系.中国医学科学院学报,2016,38:514-521.

15 田俊萍,王鸿,王红霞,等.糖尿病和非糖尿病的缺血性卒中患者血压昼夜节律与预后的关系,2016,37:62-69.

16 寇惠娟,高登峰,马瑞,等.高血压患者血压昼夜节律与早期肾损害的关系.中华高血压杂志,2015,23:661-666.

17 张强,王淑辉,杨丽红,等.原发性高血压患者血清25羟基维生素D水平与血压变异性及昼夜节律的关系.中华高血压杂志,2016,24:250-256.

18 邓建君,梅光艳,谢萍,等.持续性心房颤动对原发性高血压患者血压昼夜节律的影响.中国循环杂志,2015,30:981-983.

19 Drexler H,Hornig B.Endothelial dysfunction in human disease.J Mol Cell Cardiol,1999,31:51-60.

20 华琦,李东宝,陈海翎.比索洛尔对原发性高血压患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统及血管内皮功能的影响.首都医科大学学报,2004,25:71-73.

21 孟晓建,毛静远,侯雅竹,等.血压昼夜节律与子午流注时辰规律的相关性.中医杂志,2015,56:1378-1381.

22 全毅红,秦洁.疏血通注射液联合卡托普利对老年高血压患者血压昼夜节律及血浆内皮素和一氧化氮的影响.中国动脉硬化杂志,2011,19:347-350.

23 尹广利,王植荣,郭艺芳,等.珍菊降压片联合氨氯地平片对大鼠收缩压、内皮素及一氧化氮昼夜节律的影响.中国心血管杂志,2012,17:213-216.

24 李炳茂.大黄的降糖降压等作用.中医杂志,1992,32:8.

25 李炳茂,李耀峰,刘慧玲,等.复方大黄制剂治疗糖尿病视网膜病变200例.中医杂志,2000,41:119.

26 徐瑾.大黄的临床应用.内蒙古中医药,2014,33:56-57.

27 金兰.大黄的药理作用及临床应用进展.中国医药指南,2013,11:487-488.

28 李春盛,桂培春,何新华,等.大黄对内毒素诱导的急性肺损伤大鼠的保护作用.基础医学与临床,2001,21:65.

EffectsofbisoprololcombinedwithDahuangoncircadianrhythmofbloodpressure,NOandETinexperimentalrats

YULijie,XIAOHemei,LIFengdan,etal.

DepartmentofComprehensiveMedicine,HarrisonInternationalPeaceHospital,Hebei,Hengshui053000,China

ObjectiveTo observe the effects of bisoprolol combined with Dahuang on circadian rhythm of blood pressure(BP),nitric oxide (NO) and endothelin (ET) in experimental rats.MethodsNinety-six healthy male SD rats weighted 250～300 grams were randomly divided into three groups,with 32 rats in each group,then every group was redivided into 4 subgroups randomly,with 8 rats in each group. The rats in control group (groupⅠ) were given placebo,and the rats in group Ⅱ were given bisoprolol (3mg·kg-1·d-1) by gavage,and the rats in group Ⅲ were given bisoprolol (300mg·kg-1·d-1) by gavage.On one day before drug administration,the systolic pressure of rats was measured by rat-tail manometry in 4 different time points (02∶00,08∶00,14∶00,20∶00).After 4 weeks,the systolic pressure of rats was measured again by rat-tail manometry in the 4 different time points.Then the rats were sacrificed and myocardial tissues were obtained.The levels of ET-1,NO in myocardial tissues were detected by radioimmunity method and acid reductase method.ResultsAs compared with that in group Ⅰ,the systolic blood pressure in group Ⅱ and group Ⅲ was decreased, and the levels of ET-1 in myocardial tissues were decreased, however, the levels of NO were significantly increased (P<0.05). Moreover the decrease degree in group Ⅲ was more obvious than that in group Ⅱ (P<0.05). The levels of ET-1 in group Ⅲ were significantly lower than those in group Ⅱ(P<0.05),and the levels of NO in myocardial tissues in group Ⅲ were obviously higher than those in group Ⅱ (P<0.05).After treatment,the systolic blood pressure, amplitude,peak phase and peak time of curve of ET-1 and NO in myocardial tissues in group Ⅱ and group Ⅲ had different extent displacement (P<0.05).ConclusionThe bisoprolol combined with Dahuang has synergetic effects, which can obviously decrease blood pressure,at the same time, which has obvious effects on circadian rhythm of blood pressure and endothelial system function of rats.

circadian rhythm; bisoprolol;Dahuang; endothelin; nitric oxide

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.003

项目来源：河北省中医药管理局立项项目(编号：2014320)

053000 河北省衡水市，哈励逊国际和平医院综合内科

R 338.6

A

1002-7386(2017)18-2734-05

2017-03-13)