IL-23诱导人外周血单个核细胞对MUTZ-1细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响

2017-09-12王瑞仓刘艳芬杨洁周洁李杰郝洪岭

河北医药 2017年18期

王瑞仓刘艳芬杨洁周洁李杰郝洪岭

·论著·

王瑞仓刘艳芬杨洁周洁李杰郝洪岭

目的白介素-23(IL-23)诱导人外周血单个核细胞对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞系MUTZ-1增殖、凋亡及相关基因表达的影响。方法采用密度梯度离心法分离获得正常人外周血单个核细胞(PBMNC)，细胞分4组：阴性对照组(未加IL-23)，3个浓度IL-23组(2、10、50 ng/ml)，体外诱导72 h，并与MUTZ-1共培养。MTT实验检测MUTZ-1细胞增殖。流式细胞仪检测MUTZ-1细胞凋亡和细胞周期变化。Real time-PCR和Western-blot检测MUTZ-1细胞Bax、Bcl-2、caspase-3、survivin mRNA和蛋白表达。结果2、10、50 ng/ml IL-23诱导的PBMNC与 MUTZ-1细胞共培养后，MUTZ-1细胞增殖速度、S期细胞比例明显降低，细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例明显增加，呈时间和浓度依赖性，与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；同时Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达明显上调，Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表达明显下调，呈时间和浓度依赖性，与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论IL-23诱导PBMNC能够明显抑制MUTZ-1细胞增殖，促进MUTZ-1细胞凋亡，其机制与上调Bax、caspase-3表达、下调Bcl-2、survivin表达有关。

IL-23；MUTZ-1细胞；增殖；凋亡；基因表达

骨髓增生异常综合征(MDS)是一种起源于造血干细胞的克隆性疾病，以病态或无效造血、一系或多系血细胞质/量异常、易进展为急性髓系白血病为特征，患者生存期短[1,2]。近年来，MDS发病率存在逐年上升趋势[3]。目前，异基因造血干细胞移植是缓解患者疾病进展的重要手段。但由于骨髓供体缺乏、患者年龄限制等因素导致只有少数MDS患者接受此疗法，且移植后并不能明显降低患者病死率[4]。另外，临床治疗MDS还采用化疗、靶向治疗、诱导分化治疗等，但疗效均不甚满意，原因主要在于这些方法不能杀灭所有肿瘤细胞，患者极易复发[5]。白介素-12(IL-12)家族是一类结构类似、亚基间通过二硫键结合的细胞因子家族，主要包括IL-12、IL-23、IL-27、IL-35，在细胞免疫应答中发挥重要调控作用。研究发现，IL-12家族成员与肿瘤发生、发展密切相关，其中IL-23是IL-12家族的重要成员，主要发挥抗肿瘤及抗肿瘤转移作用[6]。本课题组前期研究发现，IL-23能促进人外周血单个核细胞(PBMNC)对白血病K562细胞的杀伤力[7]。而细胞增殖和凋亡是MDS的主要发病机制。目前，有关IL-23应用于MDS治疗及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响研究尚少。本研究旨在探讨IL-23诱导正常人PBMNC对MDS细胞系MUTZ-1增殖、凋亡及相关基因表达的影响，以期为MDS的免疫治疗提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 MUTZ-1细胞购自北京协和细胞库；重组人IL-23购自美国R&D公司；人淋巴细胞分离液、CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；caspase-3、survivin一抗购自美国Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司；Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 仪器倒置显微镜购自日本Nicon公司；Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司；7300型Real time-PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 MUTZ-1的培养:MUTZ-1加入含10%FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养MUTZ-1细胞，每2～3天传代1次。

1.3.2 PBMNC的分离、培养及分组:采集健康人清晨空腹静脉血5 ml，肝素抗凝，PBS 1∶1稀释，采用Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMNC，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养。细胞分4组：阴性对照组(PBMNC培养基中未加IL-23)，3个浓度IL-23组(PBMNC培养基中分别加入2、10、50 ng/ml IL-23)，体外诱导72 h，并与MUTZ-1共培养。

1.3.3 MTT实验:将各组MUTZ-1细胞接种于96孔板，调整细胞密度为2×104/ml，每孔200 μl，于第1、3、5、7天每孔加入MTT溶液(5 mg/nl)20 μl，4 h后离心，收集细胞，加入DMSO 150 μl，振荡混匀，在酶标仪570 nm波长处测定光密度值(A570)。

1.3.4 流式细胞术:将4组MUTZ-1细胞接种于24孔板，调整细胞密度为1×105个/孔，于第1、3、5、7天后胰酶消化细胞，PBS洗涤，加入标记荧光素FITC的Annexin V 5 μl，PI染液10 μl室温避光反应5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集MUTZ-1细胞，PBS洗涤，70%乙醇固定24 h，PI染色，流式细胞仪分析细胞周期。

1.3.5 Real time-PCR:Trizol提取细胞总RNA，严格按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。引物序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用所选仪器自带的分析软件计算后得到各样本、各基因扩增的Ct值，以GAPDH为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2-ΔΔCt。见表1。

表1 Real time-PCR引物序列及扩增产物长度

1.3.6 Western-blot:提取细胞总蛋白，半干法电泳转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，10%脱脂奶粉封闭 2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，用化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，GAPDH作为内参照，以目的蛋白与GAPDH吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 IL-23诱导PBMNC对MUTZ-1细胞增殖的影响第1天4组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第2～7天，随着IL-23浓度的加大，IL-23组MUTZ-1细胞增殖速度明显降低，其中50 ng/ml IL-23组MUTZ-1细胞增殖速度较10 ng/ml IL-23组降低，后者较2 ng/ml IL-23组降低，3组增殖速度均低于阴性对照组(P<0.05)。见表2。

2.2 IL-23诱导PBMNC对MUTZ-1细胞凋亡的影响 4组第1天比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第3～7天，随着IL-23浓度的加大，IL-23组MUTZ-1细胞凋亡率明显增加，其中50 ng/ml IL-23组MUTZ-1细胞凋亡率较10 ng/ml IL-23组增加，后者较2 ng/ml IL-23组增加，3组凋亡率均高于阴性对照组(P<0.05)。见表3。