不同TNM分期肝癌患者微血管密度与肿瘤标志物水平相关性研究
2017-09-12党存曙刘大鹏赵孟杰刘志春杨明
党存曙 刘大鹏 赵孟杰 刘志春 杨明
·论著·
不同TNM分期肝癌患者微血管密度与肿瘤标志物水平相关性研究
党存曙 刘大鹏 赵孟杰 刘志春 杨明
目的探讨不同TNM分期肝癌患者微血管密度(microvessel density，MVD)与肿瘤标志物水平的相关性。方法选取我院接受肝癌手术治疗的患者70例，同期因外伤接受肝脏手术的患者20例，健康体检者20例，采用免疫组织化学法检测不同分期肿瘤组织、癌旁组织以及正常肝脏组织中的MVD水平，采用酶联免疫分析法(ELISA)检测血清甲胎蛋白(AFP)、恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平。结果与正常肝脏组织比较，肿瘤组织及癌旁组织中MVD水平较高，且肿瘤组织高于癌旁组织(P<0.05)；肿瘤组织中MVD水平随TNM分期增高而增加，且不同分期间比较差异有统计学意义(P<0.05)；与健康体检者比较，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明显较高(P<0.05)；肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平随TNM分期增高而增加，且不同分期比较差异有统计学意义(P<0.05)；肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分别与MVD呈正相关(r值分别为0.853,0.920,0.846，P<0.05)。结论肝癌患者肿瘤组织的MVD及肿瘤标志物AFP、TSGF、VEGF水平与临床TNM分期有关，TNM分期越高，MVD及AFP、TSGF、VEGF水平越高，且患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分别与MVD呈正相关关系，提示肿瘤标志物AFP、TSGF、VEGF水平与肝癌侵袭、转移能力有关。
肝肿瘤；TNM分期；微血管密度；肿瘤标志物；相关性
原发性肝癌(PHC)是中年男性人群常见的恶性肿瘤，其发生与酒精、病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉素等化学致癌物质、水土环境等因素有关，病理类型以肝细胞癌最为常见，占70%～85%[1,2]。统计资料显示，我国每年约有46.61万新发PHC患者，每年约42.21万患者因PHC死亡[3]，并且该发病率随着工业社会发展、人口老龄化、生活节奏改变等仍不断增加。PHC起病隐匿、恶性程度高、进展迅速、易复发转移，从确诊开始的平均生存期仅为4个月左右，因此早期诊断、明确临床分期，对于及时控制肿瘤生长、浸润、转移尤为重要。肿瘤标志物是恶性肿瘤细胞相关的特异性物质，对于PHC的早期诊断具有非常重要的意义[4]。现代研究认为，血管形成在恶性肿瘤的发展中起到重要作用，不仅能为肿瘤细胞提供营养物质，促进其生长增殖，还为肿瘤的转移提供了路径[5]。微血管密度(MVD)是反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数[6]，与肿瘤生长、转移、预后关系密切。本研究主要探讨不同TNM分期肝癌患者的MVD及与肿瘤标志物水平的相关性，报告如下。
1 资料与方法
1.1一般资料收集自2011年5月到2013年1月在中国石油天然气集团公司中心医院外科接受肝癌手术治疗的患者70例，男51例，女19例；年龄35～72岁，平均年龄(53.82±9.74)岁；肿瘤TNM临床分期:Ⅰ期17例，Ⅱ期24例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；术中取患者的肿瘤组织、癌旁组织作为研究标本。选取20例同期因外伤接受肝脏手术的患者，其中男15例，女5例；年龄32～73岁，平均年龄(52.63±9.28)岁，取其正常肝脏组织标本。所有组织标本常规固定、脱水、石蜡包埋，制备4 μm的组织石蜡切片备用。另外选取20例同期健康体检者，其中男14例，女6例;年龄34～70岁，平均年龄(51.84±8.92)岁。
1.2纳入与排除标准
1.2.1纳入标准：符合2011年中国抗癌协会肝癌专业委员会、中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会、中华医学会肝病学会肝癌学组《原发性肝癌规范化病理诊断方案专家共识》关于原发性肝细胞癌的诊断标准[7]，且经术后病理学检查确诊。
1.2.2排除标准：术前接受过放疗、化疗或其他任何针对肿瘤治疗的患者，存在手术禁忌证、无法耐受手术治疗的患者，合并其他部位恶性肿瘤的患者，孕期、哺乳期女性，临床资料不完整的患者。
1.3主要试剂与仪器鼠抗人CD34单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；S-P免疫组织化学试剂盒(包含试剂A：内源性过氧化物酶阻断剂，B：正常动物非免疫血清，C：生物素标记的第二抗体，D：链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶)，购自福州迈新生物技术开发有限公司； DAB显色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；PBS溶液、枸橼酸缓冲液、1%盐酸酒精，购自南京森贝伽生物科技有限公司；人甲胎蛋白(AFP)、恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒，购自上海仁捷生物科技有限公司；DM300徕卡光学显微镜，德国Leica公司产品； Freedom EVOlyzer全自动酶联免疫分析仪，瑞士Tecan公司。
1.4研究方法受检者于术前采集清晨空腹静脉血5 ml。血液样本均置于含有肝素的抗凝管中，静置1 h，3 000 r/min离心15 min，取血清置于-20℃环境保存备用。
1.4.1免疫组织化学法检测组织CD34表达:取出石蜡切片置于烘片机中，70℃烘烤1 h，依次进行二甲苯脱蜡、梯度浓度酒精(95%-85%-75%-65%)水化；严格按照S-P免疫组织化学试剂盒的说明书步骤进行操作，将切片浸入枸橼酸盐缓冲液，微波炉高温加热至沸腾，冷却后再加热，重复冷却进行抗原修复；切片采用PBS冲洗2 min×3次，滴加50 μl试剂A，室温孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶；切片采用PBS冲洗2 min×3次，滴加试剂B封闭20 min；除去试剂B，滴加鼠抗人CD34单克隆抗体(1∶60稀释)，4℃过夜；切片采用PBS冲洗2 min×3次，滴加试剂C，37℃孵育30 min；采用PBS冲洗2 min×3次，滴加50 μl试剂D，37℃孵育10 min；切片采用PBS洗涤5 min×4次，滴加DAB显色剂显色5 min，自来水充分冲洗终止显色；切片一次采用苏木素进行复染，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗蓝化；常规脱水、透明、干燥，中性树胶封片；在光学显微镜下对组织切片进行观察、分析。
1.4.2 ELISA法检测血清AFP、TSGF、VEGF水平:取出保存的血清样本，按照AFP、TSGF、VEGF ELISA试剂盒的说明书步骤，采用全自动酶联免疫分析仪检测血清中AFP、TSGF、VEGF水平。
1.5免疫组织化学染色结果判定及MVD计数CD34主要位于血管内皮细胞膜，染色呈棕色或棕褐色，常用来标记微血管；由两位高年资病理医师对切片进行观察，参照Weidner血管计数法，先在低倍光镜(×100)下观察，选取5个微血管染色密度最高的视野，再于高倍镜(×400)下观察，对5个视野内的MVD进行计数，之后取平均值作为最终结果。微血管计数标准：任何内皮细胞或细胞簇染色呈棕黄色，并且与周围组织、血管、细胞等区别明显，均可看作一个血管进行计数；若血管腔>8个红细胞直径，或血管壁具有较厚基层，或微血管位于细胞稀少区域、纤维硬化区域、炎症区域，或微血管染色模糊，均不计数[8]。
2 结果
2.1肿瘤组织、癌旁组织及正常肝脏中MVD的差异CD34染色阳性的血管内皮细胞胞浆内散在分布棕黄色颗粒，CD34标记阳性的血管内皮作为MVD计数的血管。本研究中，正常肝脏组织CD34染色较浅，MVD水平为(5.88±0.82)；癌旁组织CD34染色主要分布于汇管区周围肝实质内血窦，MVD水平为(16.73±2.31)；肿瘤组织CD34染色程度较深，主要分布于肿瘤周边，形态呈点状、线状、窦隙状、簇状等，MVD水平为(33.31±4.73)。与正常肝脏组织比较，肿瘤组织及癌旁组织中MVD的水平较高，且肿瘤组织>癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1～3。
表1 肿瘤组织、癌旁组织及正常肝脏中的MVD差异
注：与肿瘤组织比较，*P<0.05；与癌旁组织比较，#P<0.05
图1 正常肝脏组织的MVD情况(免疫组化×400)
图2 癌旁组织的MVD情况(免疫组化×400)
2.2 不同TNM分期肿瘤组织的MVD水平比较 不同TNM分期肿瘤组织中MVD水平比较，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图4～7。
图3 肿瘤组织的MVD情况(免疫组化×400)
表2 不同TNM分期肝癌肿瘤组织MVD水平比较
注：与Ⅰ期比较,*P<0.05；与Ⅱ期比较，#P<0.05；与Ⅲ期比较，△P<0.05
图4 TNMⅠ期肿瘤组织MVD情况(免疫组化×400)
图5 TNMⅡ期肿瘤组织MVD情况(免疫组化×400)
2.3 肝癌患者与健康体检者血清AFP、TSGF、VEGF水平比较 与健康体检者比较，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明显较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。
图6 TNMⅢ期肿瘤组织MVD情况(免疫组化×400)
图7 TNMⅣ期肿瘤组织MVD情况(免疫组化×400)
表3 肝癌患者与健康体检者血清AFP、TSGF、VEGF水平比较
2.4 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比较 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比较，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表4 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比较
注：与Ⅰ期比较,*P<0.05；与Ⅱ期比较，#P<0.05；与Ⅲ期比较，△P<0.05
2.5 肝癌患者的MVD与血清AFP、TSGF、VEGF水平相关性 经Pearson线性相关性分析，肝癌患者的MVD与血清AFP、TSGF、VEGF水平呈正相关(r值分别为0.853,0.920,0.846,P<0.05)。见图8～10。
图8 肝癌患者MVD与血清AFP水平相关性(r=0.8534)
3 讨论
有研究认为，肿瘤生长包括两个阶段，无新生血管形成时，肿瘤组织主要依靠弥散供氧，生长缓慢，微血管生成后，可以为肿瘤细胞生长提供必需的营养物质以及转移路径，肿瘤生长迅速，并且出现侵袭、转移情况[9]，可见，肿瘤组织内微血管形成在PHC病情进展过程中起到重要作用[10]。MVD是反映肿瘤内血管形成情况的客观指标，MVD水平与肿瘤的侵袭、转移能力关系密切。在本研究中，我们采用CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，用于MVD计数，分析肝癌肿瘤组织MVD的水平。CD34抗原是表面分子唾液粘蛋白的一种，属于糖基化Ⅰ型膜蛋白，具有促进细胞间黏附及造血细胞分化的作用，主要选择性的表达于微血管内皮细胞。CD34抗体能够特异性结合CD34抗原，造成微血管内皮细胞染色，有助于MVD计数[11]。
图9 肝癌患者MVD与血清TSGF水平相关性(r=0.9203)
图10 肝癌患者MVD与血清VEGF水平相关性(r=0.8458)
本研究结果显示，与正常肝脏组织比较，肿瘤组织及癌旁组织中MVD水平较高，且肿瘤组织>癌旁组织(P<0.05)，提示MVD水平升高与肿瘤组织的进展程度有关。不同TNM分期肿瘤组织中MVD水平比较，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期(P<0.05)，TNM分期是根据肿瘤原发灶、区域淋巴结受累、远处转移情况划分的，分期越高，肿瘤的进展程度越高，预后越差[12]，研究结果说明TNM分期不同，肿瘤组织的MVD水平不同，MVD水平越高，肿瘤侵袭、转移能力越强，预后越差。
肿瘤标志物肿瘤是恶性肿瘤细胞相关的特异性物质，能够用于肿瘤的筛查、早期诊断、治疗效果监测、预后判断等，AFP、TSGF、VEGF均为肝癌常见的肿瘤标志物[13]。AFP是一种酸性糖蛋白，生理情况下，主要来自胚胎的肝细胞，成人血清含量较低，而癌变的肝细胞可以产生AFP，使得其血清水平异常升高，可用于肝癌早期诊断，敏感性约70%[14]；TSGF是新型肿瘤标志物，属于可溶性多肽类物质，主要由恶性肿瘤细胞分泌，能够促进外周毛细血管扩增，可与AFP等联合检测提高诊断肝癌的精确度[15]；VEGF是作用最强的促进血管生成因子，在多种恶性肿瘤中呈高表达状态，不仅能够强烈刺激血管生成，为肿瘤细胞提高氧气和营养，还能增加血管的通透性，促进肿瘤细胞进入血液循环，发生远处转移[16,17]。本次研究显示，与健康体检者比较，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明显较高(P<0.05)，不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比较，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期(P<0.05)，表明肝癌患者肿瘤标志物水平与肿瘤分期有关，AFP、TSGF、VEGF水平越高，提示肿瘤分期越高。Pearson线性相关性分析，肝癌患者MVD与血清AFP、TSGF、VEGF水平分别呈正相关(r值分别为0.853,0.920,0.846，P<0.05)，提示肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平能够反映肿瘤内血管形成程度以及侵袭、转移能力。
综上所述，肝癌患者肿瘤组织的MVD及肿瘤标志物AFP、TSGF、VEGF水平与临床TNM分期有关，TNM分期越高，MVD及AFP、TSGF、VEGF水平越高，且患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分别与MVD水平呈正相关关系，提示肿瘤标志物AFP、TSGF、VEGF水平与肝癌侵袭、转移能力有关，可用于肝癌患者复发、转移的检测以及预后评估。
1 文军.原发性肝癌血清肿瘤标记物的研究进展.中国伤残医学,2013,21:458-459.
2 张少鹏,姚树坤,宋威江,等.中药单体治疗原发性肝癌实验研究进展.中日友好医院学报,2016,30:315-316.
3 陈洁,曾庆磊,李晶晶,等.精氨酸剥夺治疗在肝细胞癌中的研究进展.肝脏,2016,25:995-999.
4 Toyoda H,Kumada T,Tada T,et al.Tumor Markers for Hepatocellular Carcinoma: Simple and Significant Predictors of Outcome in Patients with HCC.Liver cancer,2015,4:126.
5 Riabov V,Gudima A,Wang N,et al.Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis.Frontiers in Physiology,2014,5:75.
6 马振,黄晶晶.超声造影技术在肝肿瘤血管生成评价中的应用.中华医学超声杂志电子版,2015,12:615-618.
7 中国抗癌协会肝癌专业委员会、中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会、中华医学会肝病学会肝癌学组、全国肝胆肿瘤及移植病理协作组.原发性肝癌规范化病理诊断方案专家共识.临床与实验病理学杂志,2010,26:645-647.
8 周红凤,吴瑾,陈桂云,等.乳腺癌组织和血清中VEGF、bFGF的表达和微血管密度的关系.哈尔滨医科大学学报,2012,46:248-252.
9 Yamashita M,Ogawa T,Zhang X,et al.Role of stromal myofibroblasts in invasive breast cancer: stromal expression of alpha-smooth muscle actin correlates with worse clinical outcome.Breast Cancer,2012,19:170-176.
10 杨晓林.原发性肝癌肿瘤血管密度及其表达的临床病理意义.黑龙江医药,2016,29:152-154.
11 冯子明,袁中平,董谢平,等.转移瘤CD34及微血管表达的研究.实用临床医学,2014,15:33.
12 陶一明,冯铁诚,王志明,等.原发性肝癌患者TNM分期与术后生存关系:SEER数据库分析.中国普通外科杂志,2016,25:952-956.
13 张天明,王玉平,周永宁.肝癌肿瘤标记物的研究进展.胃肠病学和肝病学杂志,2016,25:852-856.
14 谢康珍,杨玉秀.肝细胞肝癌早期诊断肿瘤标志物的研究进展.中国实用医刊,2015,42:116-118.
15 Zhao Y,Wang M,Cui C,et al.Significance of combined tests of serum golgi glycoprotein 73 and other biomarkers in diagnosis of small primary hepatocellular carcinoma.Cancer Biomarkers,2015,15:677.
16 杨素丽,谢风.肿瘤标志物检测应用于原发性肝癌的研究进展.中国实验诊断学,2015,19:1981-1982.
17 Cigrovski Berkovic M, Cacev T, Catela Ivkovic T,et al.High VEGF serum values are associated with locoregional spread of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.Molecular and Cellular Endocrinology,2016,4:61-68.
StudyonthecorrelationbetweenmicrovesseldensityandtumormarkerlevelsindifferentTNMstagesoflivercancer
DANGCunshu,LIUDapeng,ZHAOMengjie,etal.
CentralHospitalofChinaPetroleumNaturalGasGroup,Hebei,Langfang065000,China
ObjectiveTo investigate the correlation between microvessel density(MVD) and tumor marker levels in different TNM stages of liver cancer.MethodsSeventy patients with liver cancer who
surgical treatment were enrolled as liver cancer group,the other 20 patients with liver external injury who underwent surgery were enrolled as liver surgery group, moreover 20 healthy subjects were enrolled as control group,The MDA levels were detected by immunohistochemistry in tumor tissues, paracancerous tissues and normal liver tissues,and the serum levels of alpha fetoprotein (AFP),tumor specific growth factor (TSGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsAs compared with those in normal liver tissues,the levels of MVD in tumor tissues and adjacent tissues were higher,moreover,which in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.05). The levels of MVD in tumor tissues were increased with the increase of TNM stages,furthermore, there were significant differences in the levels of MVD among different stages,stageⅠ liver cancer; TNM stages; MVD; tumor marker; correlation 10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.001 项目来源：河北省廊坊市科技支撑计划项目(编号：2011013036) 065000 河北省廊坊市，中国石油天然气集团公司中心医院(党存曙、刘大鹏、赵孟杰、刘志春)；河北省廊坊市人民医院(杨明) R 735.7 A 1002-7386(2017)18-2725-05 2017-02-15)
