苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

刘雪华，宋琎楠，张玉喜，侯丽霞，于延冲，赵方贵，刘春英，董春海，杨洪兵

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

刘雪华，宋琎楠，张玉喜，侯丽霞，于延冲，赵方贵，刘春英，董春海，杨洪兵

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

为深入研究液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用，以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料，利用同源克隆方法得到NHX基因，命名为FtNHX1，并在GenBank中注册，登录号为KY438929；序列分析表明，该基因开放阅读框1 662 bp，共编码553个氨基酸，预测蛋白分子量61.24 kDa，等电点5.15。系统进化树分析表明，FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近，氨基酸同源率分别为60.22%，58.95%和57.30%；荧光定量PCR分析表明，随着NaCl胁迫浓度的增加，FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加，150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大，分别比对照增加了254.10%，311.35%和256.18%；NaCl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%，145.67%和155.94%，茎基部和叶片的平均表达量较高，说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节，FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。

苦荞麦；盐胁迫；基因克隆；相对表达量；耐盐性

土壤盐渍化是限制农作物产量的重要非生物胁迫之一[1]；因为过高的Na+会干扰细胞内离子平衡，导致代谢活动失调及破坏细胞膜结构，从而抑制细胞生长甚至死亡[2-3]。植物抵御Na+的侵害主要分为2种形式，即排Na+和Na+的区隔化，其中液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白以H+-ATPase形成的H+跨膜电化学梯度为驱动力，将细胞质中Na+泵入液泡进行Na+的区隔化，从而提高植物的耐盐性[4-6]。Apse等[7]从拟南芥中鉴定出第一个高等植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1，随后在多种植物中克隆到了Na+/H+逆向转运蛋白基因。NaCl胁迫下，拟南芥过表达AtNHX1的转基因植株中Na+含量明显高于野生型[8]。

荞麦是双子叶蓼科(Polygonaceae)、荞麦属(Fagopyrum)植物，具有很高的营养价值和保健功效，主要栽培品种有甜荞麦(Fagopyrumesculentum)和苦荞麦(Fagopyrumtartaricum)[9]。苦荞麦营养丰富，抗逆性更强，目前的研究主要集中在品质营养及栽培方面，在分子遗传育种和耐盐相关基因克隆方面研究较少[10]。本研究以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料克隆FtNHX1基因，分析不同浓度盐胁迫对FtNHX1基因表达量的影响及其在苦荞麦不同部位的表达差异，为植物耐盐分子机理研究提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料培养与处理

以耐盐苦荞麦品种川荞1号为试验材料，挑选籽粒饱满的种子，1 g/L高锰酸钾溶液浸泡消毒10 min，去离子水通气吸涨5 h，种子均匀摆放在铺有湿纱布的培养皿，26 ℃恒温箱培养，种子萌发后移至新培养皿，1/2 Hoagland营养液培养，自然光照，昼夜温度26 ℃/16 ℃，相对湿度为60%左右，培养至两叶一心期开始NaCl胁迫处理，NaCl(1/2 Hoagland营养液配制)浓度为50，100，150 mmol/L，胁迫处理2 d。每个处理设3次重复。

1.2FtNHX1 基因的克隆

取两叶一心期对照苦荞麦幼苗叶片，去离子水冲洗2遍，称取0.1 g，液氮研磨至粉末，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，电泳检测其质量，分光光光度计测定RNA浓度，以此RNA为模板进行反转录，cDNA合成按照Prime Script RTase反转录试剂盒(TaKaRa)方法进行。根据NCBI GenBank数据库中注册的苦荞麦FtNHX1的序列(登录号：KY438929)，设计正反向引物P1和P2(表1)，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增，将得到产物进行凝胶检测，目的片段胶回收，连接到pMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，用含有50 mg/L氨苄固体培养基进行筛选，PCR鉴定的阳性菌株由上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.3 荧光定量PCR分析

分别取对照和不同浓度NaCl胁迫处理的苦荞麦根部、茎基部和叶片材料，去离子水冲洗2遍，吸干水分，各称取0.1 g，提取RNA(方法同1.2)，按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)方法反转录成cDNA。实时荧光定量PCR引物为FtNHX1-F和FtNHX1-R引物序列，选用内参基因Actin的实时荧光定量PCR引物为Actin-F和Actin-R引物序列(表1)。参考SYBR® PremixExTaqⅡ试剂盒(TaKaRa)方法在Agilent Technologies Stratagene Mx3000P仪器上进行实时荧光定量PCR，采用2-ΔΔCT的方法[11-12]计算FtNHX1基因在苦荞麦不同部位的相对表达量。

表1 荧光定量PCR分析所用引物Tab.1 The primers of RT-qPCR

1.4 数据处理和分析

数据处理采用SPSS软件，进行标准偏差和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苦荞麦RNA的提取与FtNHX1基因克隆及序列分析

以川荞1号叶片为材料提取RNA，得到的RNA用1.2%琼脂糖凝胶、150 V电压电泳15 min，电泳结果如图1所示。检测RNA浓度在叶片中浓度平均1 000 ng/μL，茎基部浓度平均500 ng/μL，根部浓度平均200 ng/μL，OD600为1.8～2.0。用叶片RNA为模板反转录成cDNA，以该cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，发现在1 500 ～2 000 bp有一条明显的亮带，且没有杂带，与目的片段大小一致，如图2。

1，2，3.RNA提取物。1，2，3.RNA extraction.

该片段回收纯化，测序发现该基因开放阅读框1 662 bp，编码553个氨基酸，预测蛋白分子量61.24 kDa，等电点5.15。经过比对该基因编码的氨基酸序列与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白相似度较高，命名为FtNHX1，GenBank注册登录号为KY438929。

CDS序列见图3。

M.DL5000 DNA Marker。

2.2 FtNHX1蛋白的同源序列比对及系统进化树分析

将FtNHX1蛋白的氨基酸序列与GenBank中其他植物NHX的氨基酸序列进行比对，发现FtNHX1与拟南芥(Arabidopsisthaliana)的AtNHX1、水稻(Oryzasativa)的OsNHX6和小麦(Triticumaestivum)的TaNHX1序列相近，氨基酸同源率分别为60.22%，58.95%和57.30%，且高度保守区有氨氯吡嗪咪结合位点(lffiyllppi)，见图4中矩形区域，可能与Na+的竞争性抑制有关。

利用在线分析程序SOPMA进行蛋白的二级结构预测，发现其二级结构中α螺旋含量为37.97%，β转角为8.50%，延伸链为23.33%，无规则卷曲为30.20%(图5)。

图4 FtNHX1与其他植物NHX的氨基酸序列比对Fig.4 Amino acid sequence alignment of FtNHX1 and other plants NHX

h.α螺旋；t.β转角；e.延伸链；c.无规则卷曲。h.α helix；t.β turning corner;e.Extended chain;c.Random crimp.

为进一步分析FtNHX1与其他植物Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系，对植物NHX蛋白和SOS1蛋白进行了系统进化树分析(图6)，FtNHX1与液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较近，而与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远，通过氨基酸序列比对分析，FtNHX1应为液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的相关基因。

At.拟南芥；Ft.苦荞；Gm.大豆；Os.水稻；Ta.小麦；Zm.玉米。At.Arabidopsis thaliana;Ft.Fagopyrum tartaricum;Gm.Glycine max;Os. Oryza sativa;Ta.Triticum aestivum;Zm.Zea mays .

2.3 不同浓度NaCl胁迫对苦荞麦FtNHX1基因相对表达量的影响

在小麦[13]、拟南芥[14]和马蔺[11]等植物中，液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX受盐胁迫的诱导调节，该基因可将细胞质中的Na+泵入液泡内将Na+区隔化，以减少Na+的毒害作用。图7所示，50，100和150 mmol/L NaCl胁迫下，川荞1号FtNHX1基因相对表达量都极显著增加，根部分别比对照增加了23.14%，51.14%和254.10%；茎基部分别比对照增加了35.06%，90.61%和311.35%；叶片分别比对照增加了67.65%，144.00%和256.18%，FtNHX1基因均在150 mmol/L NaCl胁迫下达到最大相对表达。

取标准差作误差线，n=3，**.P<0.01。图8同。Values are means±SD，n= 3，**.P < 0.01. The same as Fig.8.

2.4 NaCl胁迫下苦荞麦FtNHX1基因在不同部位的平均表达量

图8可见，NaCl胁迫下，川荞1号FtNHX1基因在不同部位的平均表达量都显著增加，根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%，145.67%和155.94%，茎基部和叶片的FtNHX1基因平均表达量较高。说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节。

3 讨论与结论

荞麦是蓼科植物，荞麦根系比较细，荞麦的根系很容易褐化，会影响RNA的提取，所以在提取RNA的过程中，要保证材料足量，更要保证材料的新鲜，要在液氮中冷冻并快速研磨，才能提高RNA的质量。荞麦叶片和茎基部RNA的提取较根部而言相对容易，但RNA很容易降解，所以在提取过程要保持相对较低的温度，尽量放置于冰上，从而防止RNA的降解。

图8 NaCl胁迫下苦荞麦FtNHX1基因在不同部位的平均表达量 Fig.8 The average expression of FtNHX1 gene in different parts of tartary buckwheat under NaCl stress

近年来，高等植物基因表达调控的研究进一步深入，其中逆境胁迫诱导植物抗逆相关基因的表达是研究的一个重要方面[15]。盐渍环境可对植物产生渗透胁迫、氧化胁迫及离子毒害等效应[13]；过高Na+水平扰乱细胞内离子平衡，导致膜功能失调或代谢活动紊乱，从而抑制植物细胞生长甚至导致细胞死亡，植物为了抵御Na+离子毒害通常会有2种主要适应形式：一种是将Na+泵到液泡区隔化，维持膨压和细胞吸水[16-17]；另一种是将Na+泵到细胞外排Na+，从而提高植物的耐盐性[18]。植物Na+/H+逆向转运蛋白家族可分为两类，即液泡膜型和质膜型[19]，液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白的作用就是将细胞质中过高的Na+转运到液泡内进行Na+的区隔化，从而减少Na+的毒害；质膜型Na+/H+逆向转运蛋白是将细胞质内的Na+转运到细胞外进行Na+外排，减少Na+的毒害。

液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)活性首先在甜菜(Betavulgaris)根中检测到[20]；NHX可将细胞质中Na+区隔化到液泡，在植物拒Na+过程中发挥重要作用[21]。本研究从苦荞麦中分离得到液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因FtNHX1，其开放阅读框ORF区1 662 bp，共编码553个氨基酸，具有完整的编码液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA序列[22]，与拟南芥AtNHX1的氨基酸同源率高达60%以上，且高度保守区有氨氯吡嗪咪结合位点(LFFIYLLPPI)，LFFIYLLPPI是结合Na+的位点，负责Na+转运；通过系统进化树分析，FtNHX1与液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较近，推测FtNHX1定位表达于液泡膜，与其他植物液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因有类似功能。

Na+/H+逆向转运蛋白在细菌、酵母、藻类、动物和高等植物膜系统上普遍存在，它参与细胞质内的pH调节，Na+浓度调节及细胞体积变化等活动[23- 24]。盐胁迫下，紫花苜蓿液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因MsNHX1表达量明显增加，MsNHX1蛋白分子数也明显增加[25]；随盐浓度的升高，马蔺NHX基因的表达量也不断升高，说明该基因的表达量受盐胁迫的诱导调节，在耐盐过程中发挥重要作用[11]；将小麦和紫花苜蓿的Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中过表达，都明显提高了转基因植株的耐盐性，而拟南芥本身并无不良反应[26-27]。本研究中随着NaCl胁迫浓度的增加，苦荞麦根部、茎基部和叶片FtNHX1基因的表达量都呈显著增加趋势，其中在NaCl胁迫浓度最大时，苦荞麦不同部位FtNHX1基因的表达量都达到最高水平，在茎基部的表达量最高，其次是叶片，根中的表达量比叶片稍低；并且NaCl胁迫下苦荞麦不同部位FtNHX1基因的平均表达量都比对照增加了1倍以上，说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫的诱导和调节，FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。本研究对苦荞麦FtNHX1的氨基酸序列、蛋白结构进行了初步分析，也探究了苦荞麦FtNHX1基因的表达特性，为进一步研究该基因在苦荞麦中的抗逆机理起到铺垫作用，也为研究其他抗逆基因的抗逆机理提供了一定的参考作用。苦荞麦具有较强的抗逆性，本身可能蕴含着大量的抗性基因，本研究为探讨荞麦耐盐机制提供了理论依据，为进一步分析FtNHX1基因功能奠定了基础。

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Cloning and Expression Analysis ofFtNHX1 in Tartary Buckwheat

LIU Xuehua，SONG Jinnan，ZHANG Yuxi，HOU Lixia，YU Yanchong，ZHAO Fanggui，LIU Chunying，DONG Chunhai，YANG Hongbing

(College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong，Qingdao 266109，China)

In order to further study the Na+/H+antiporter roles of vacuole membrane in salt tolerance of plants，the salt-tolerant tartary buckwheat variety Chuanqiao No.1 was used as materials，and theNHXgene was obtained by homology cloning，which namedFtNHX1，and registered in GenBank，the landing number was KY438929. Sequence analysis showed that the open reading frame ofFtNHX1 was 1 662 bp，encoding 553 amino acids，with predicted molecular weight of 61.24 kDa and isoelectric point of 5.15. Phylogenetic tree analysis showed that FtNHX1 was closely related to AtNHX1，OsNHX1 and TaNHX1，with 60.22%，58.95% and 57.30% amino acid homology rates. Quantitative real-time PCR analysis showed that the relative expression ofFtNHX1 gene in roots，stem base and leaf of tartary buckwheat was significantly increased with the concentration increasing of NaCl stress，and that increased the most under NaCl stress of 150 mmol/L，which was increased by 254.10%，311.35% and 256.18% respectively in contrast with control. The average expression ofFtNHX1 gene in roots and stem base and leaf of tartary buckwheat was increased by 109.46%，145.67% and 155.94% in contrast with control under NaCl stress，and that in stem base and leaf was very higher，indicating that the expression ofFtNHX1 gene in tartary buckwheat was obviously induced and regulated by salt stress，and there was a close relationship between theFtNHX1 gene and the salt tolerance of tartary buckwheat.

Tartary buckwheat；Salt stress；Gene cloning；Relative expression；Salt tolerance

2017-06-13

国家自然科学基金项目(31371552)；山东省自然科学基金项目(ZR2010CL019)

刘雪华(1990-)，女，山东潍坊人，在读硕士，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。刘雪华、宋琎楠为同等贡献作者。

杨洪兵(1968-)，男，山东日照人，教授，博士，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。

Q78；S517

A

1000-7091(2017)04-0049-06

10.7668/hbnxb.2017.04.008