甘丙肽系统在雌性焦虑抑郁样小鼠海马中的表达和作用☆

陈国艳杨伟毅胡晓辉邹慧莉雷革胜宿长军

·论 著·

甘丙肽系统在雌性焦虑抑郁样小鼠海马中的表达和作用☆

陈国艳*杨伟毅*胡晓辉*邹慧莉*雷革胜*宿长军*

目的研究在雌性焦虑抑郁样行为小鼠海马中甘丙肽及其受体的表达和所起的作用。方法制备甘丙肽及甘丙肽受体-1（galanin receptor subtybe 1，GalR1）、受体-2（GalR2）、受体-3（GalR3）探针，运用原位杂交技术观察甘丙肽及其受体GalR1、GalR2、GalR3在雌性C57BL/6J小鼠海马中分布情况。另取雌性C57BL/6J小鼠随机分为实验组（15只）与对照组（15只），实验组给予慢性温和型不可预见性刺激（chronic unpredictability mild stress，CUMS）4周，对照组不给予任何刺激。4周后分别行糖水偏好实验、新物体识别实验、旷场实验及悬尾实验以评估小鼠的焦虑抑郁样行为水平及工作记忆情况；行为实验后，每组8只小鼠提取海马RNA行qPCR以检测海马甘丙肽及其受体表达情况，其余小鼠取脑行免疫荧光染色检测海马C-Fos阳性细胞数。结果原位杂交结果显示甘丙肽及其受体GalR1、GalR2在腹侧海马Hilus区有表达，GalR3未见阳性信号。糖水偏好实验实验组较对照组糖水饮用量减少（P＜0.05）；新物体识别实验显示，实验组比对照组探索新物体时间百分比短（P＜0.05）；旷场实验中，实验组小鼠较对照组中间停留时间缩短（P＜0.05）；悬尾实验中，实验组较对照组累计静止时间延长（P＜0.05）。qPCR结果示实验组小鼠海马甘丙肽及GalR1表达较对照组增高（P＜0.05）。免疫组化结果示实验组小鼠海马齿状回C-Fos阳性细胞较对照组增多（P＜0.05）。结论甘丙肽、GalR1及GalR2主要分布在小鼠海马的腹侧Hillus区；在雌性C57BL/6J小鼠中，海马甘丙肽及GalR1的增加可能与焦虑抑郁样行为有关，与海马齿状回C-Fos细胞增加也有关。

甘丙肽 甘丙肽受体 慢性温和型不可预见性刺激 原位杂交

神经肽可能参与抑郁症的发生发展过程[1]。甘丙肽（Galanin）作为一种压力诱导相关的神经肽，与其受体广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统，参与焦虑抑郁样行为及认知行为的调节[2-4]。同时，也有研究显示压力相关的精神性疾病，如焦虑抑郁样精神障碍存在明显的性别差异，女性的患病率是男性的2倍[5-6]。尽管该类疾病在女性中更多见，然而以往关于甘丙肽及其受体参与焦虑抑郁样情绪调节的相关研究多以雄性大鼠或小鼠为研究对象，缺少对雌性小鼠的研究，故本研究选择雌性C57BL/6J小鼠为研究对象，旨在更好地反映在压力诱导焦虑抑郁样疾病中甘丙肽及甘丙肽受体-1（galanin receptor subtybe 1，GalR1）、受体-2（GalR2）、受体-3（GalR3）在小鼠海马中的表达情况。

1 对象与方法

1.1 研究动物鉴于小鼠出生后海马已完成发育，原位杂交实验选择标准环境中饲养的1月龄雌性C57BL/6J小鼠1只。另取3月龄雌性C57BL/6J小鼠30只，体质量18～23 g。饲养于SPF级动物中心。实验组小鼠适应环境1周后，独笼饲养，每天随机给予一种刺激，包括禁水24 h、禁食24 h、潮湿笼子24 h、束缚3 h、倾斜笼子45°12 h、光剥夺24 h、13℃冷水游泳8 min、37℃温水游泳8 min，连续刺激4周。对照组小鼠5只/笼，环境温度（23±2）℃，光照/黑夜时间12 h/12 h（7:00～19: 00），作息规律，每周更换水、食物和垫料。

1.2 研究方法

1.2.1 原位杂交实验 设计并合成甘丙肽及其引物，制备地高辛标记探针，探针引物设计来源于Allenbrain（由上海英俊公司合成）。引物序列：甘丙肽上游引物ATCCT GCACTGACCAGCC，下游引物TTGGCTTGAGGAG TTGGC；GalR1上游引物TCGATCCAACTACATTCCACAG， 下 游 引 物AGTGTCTTGCTTTGTTTCCCTC；GalR2上游引物GAAATGGGAGAGGCCTAGAAAT， 下 游 引 物ATCGTCCAGGGTATAGATGGTG；GalR3上游引物CCCTACCTAAGCTACTACGGCA， 下 游 引 物GGCGGACAGGGTTAGTCTAGT。上述引物 以C57BL/6J小鼠脑DNA为模版，经PCR扩增、割胶回收、T-vector连接、转化、摇菌、抽质粒，将DNA转录为地高辛标记的mRNA，放入预杂交液中备用。原位杂交过程共3 d，第1 d全程需无RNA酶操作，将预先准备好的30 μm脑片55℃烘干2 h，10 μg/mL PK消化蛋白20 min，脑片在杂交液中60℃水浴过夜。第2 d，取出脑片，先后经2×SSC、0.2×SSC、PBT洗后，室温孵育地高辛抗体（1:2000）1h后4℃冰箱过夜。第3d，显色，固定，并甘油封片。

1.2.2 糖水偏好实验 实验中小鼠独笼饲养，并禁水、禁食12 h，之后同时给予1%糖水和水持续12 h。6 h更换一次糖水和水位置，避免位置偏好引起的糖耗量差异，12 h后计算糖水饮用量的百分比[饮糖水量/（饮糖水+水总量）×100%]，比较两组小鼠糖水消耗情况。

1.2.3 新物体识别实验 实验在隔音箱中进行，箱内有25 cm×25 cm×25 cm有机玻璃无底盒子，小鼠的行为可以被箱子中内置的摄像头记录下来。该实验过程包括3部分：适应期、学习训练期和测试期。适应期阶段每只小鼠先放在空箱子中适应10 min，取出小鼠，放回笼内。在学习训练期，分别在盒子底部对角线的2个三等分点上放2个形状相同的物体，单只小鼠背对物体放入箱中，自由探索10 min后取出小鼠放回饲养笼，该阶段计算小鼠对其中一个物体的探索时间占总探索时间的百分比，来判断小鼠是否具有位置偏好。测试期，将箱子里其中1个物体换成1个小鼠从未见过的、颜色和形状与原来物体不同的新物体，1 h后，小鼠重新回到箱子中探索新旧2个不同的物体5 min，在该阶段需计算小鼠对新物体的探索时间占总探索时间的百分比，用于判断小鼠的工作记忆。

1.2.4 旷场实验 用于检测小鼠的焦虑样行为水平，小鼠在开放场中间静息时间越短说明焦虑水平越高。将小鼠放在开放场大小为27 cm×27 cm× 20 cm盒子的左下角，实验仪器自动记录小鼠在开放场中30 min的自主运动情况，导出小鼠运动的总距离及在中心区域停留时间。

1.2.5 悬尾实验 用胶带粘住距小鼠尾巴末端1 cm处，小鼠倒挂在距地面40 cm的挂钩上，用摄像头记录6 min，统计最后4 min小鼠累计静止的时间，静止时间越长，小鼠抑郁水平越高。

1.2.6 qPCR 两组小鼠（各8只）断颈取脑，分离出海马组织，用Trizol法提取RNA，检测RNA浓度，并按Takara试剂盒说明将RNA转cDNA。PCR引物（上海英俊公司合成）序列如下：β-actin上游引物GGCTGTATTCCCCTCCATCG，下游引物CCAGT TGGTAACAATGCCATGT；甘丙肽上游引物TAGG CTGGCTCCTGTTGGTT，下游引物GGTTGTCAATG GCATGTGGG；GalR1上游引物GAACTGGCTATGG TGAACCTC，下游引物CCAAACACTACCAGCGTA ATGA；GalR2上游引物GCGGTCCTCGTACCCCTA TT，下游引物：CACAGGATGAAACACAGGTCG；GalR3上游引物CGCTCTACGCACTCTGCTGGG，下游引物GTGGCGGGAGGCAAGGGAATA。按Takara SYBR Green试剂盒要求配制10 μL体系PCR反应液，使用ABI 7500仪器行PCR检测，反应过程：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃延伸1 min，40个循环。qPCR结果以2-ΔΔCt值表示。

1.2.7 免疫荧光染色 两组小鼠（各7只）经心脏左室灌注20 mL生理盐水，4%多聚甲醛内固定，然后取脑放在4%多聚甲醛里外固定12 h，30%蔗糖脱水16 h。之后经OCT包埋，冰冻后切片，脑片厚度30 μm。在孵育一抗前，脑片用pH 7.5的柠檬酸钠95℃水浴修复8 min，后用1×PBS洗去多余的柠檬酸钠，室温孵育一抗C-Fos（rabbit）（1:1000）1 h后再4℃冰箱继续孵育过夜。次日用1×PBS洗涤多余一抗，上二抗bio-GAR（1:500），室温避光孵育3 h后，用1×PBS洗涤多余二抗，三步化Avidin-cy3（1:1000）及Hoechst（1:2000）室温孵育1 h。1×PBS洗3次，每次5 min，描片、70%甘油封片，荧光显微镜下观察并记录两组小鼠海马CFos阳性细胞数。

1.3统计学方法 应用SPSS 18进行分析，两组采用独立样本t检验，检验水准ɑ=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 原位杂交结果甘丙肽及 GalR1、GalR2的mRNA在海马有分布，主要在腹侧海马的 Hilus区，GalR3未见阳性信号。见图1。

2.2 行为实验结果糖水偏好实验中，实验组小鼠饮用糖水百分比较对照组少 （t＝2.911，P=0.010）。新物体识别实验的训练阶段中两组小鼠位置性偏好百分比差异无统计学意义（t＝0.6864，P=0.500），测试阶段中实验小鼠对新物体探索时间百分比较对照组时间短（t＝2.332，P=0.031）。见表1。

旷场实验中总运动距离比较，实验组与对照组无统计学差异（t＝1.699，P=0.104）；两组小鼠中间停留时间，实验组较对照组短 （t＝3.699，P= 0.001）。悬尾实验中，实验组较对照组静止不动时间延长（t＝2.857，P=0.011）。见表1。

2.3 qPCR结果实验组小鼠海马的甘丙肽mRNA表达水平较对照组高（t＝4.080，P=0.007），实验组GalR1 mRNA表达水平较对照组增高（t＝2.378，P= 0.039），GalR2 mRNA（t＝0.465，P=0.652）及GalR3 mRNA（t＝2.315，P=0.060）表达水平与对照组比差异无统计学意义。见表2。

图1 原位杂交实验中甘丙肽、Gal R1及Gal R2在C57BL/6J小鼠海马的分布。图A1、B1、C1分别表示甘丙肽、Gal R1、Gal R2在背侧海马未见明显阳性信号；图A2、B2、C2分别表示甘丙肽、Gal R1、Gal R2在腹侧海马的分布情况。三角箭头所指为阳性信号，标尺为100 μm

表1 两组小鼠行为学实验结果（±s）

表1 两组小鼠行为学实验结果（±s）

1）与对照组比较，经独立样本t检验，P＜0.05

组别n 新物体识别实验 旷场实验位置性偏好百分比54.3%±2.5% 51.7%±2.8% 15 15实验组对照组糖水偏好实验饮糖水百分比59.2%±10.3%1)93.1%±1.6%新物体探索时间百分比62.6%±2.3%1)70.8%±2.7%总运动距离（cm）6068.0±389.0 5277.0±235.3中间停留时间（s）53.1±6.51)143.8±24.6悬尾实验静止不动时间（s）128.8±13.61)77.0±12.1

表2 两组小鼠海马区甘丙肽、GalR1、GalR2、GalR3 mRNA表达水平（±s）

表2 两组小鼠海马区甘丙肽、GalR1、GalR2、GalR3 mRNA表达水平（±s）

1）与对照组比较，经独立样本t检验，P＜0.05

组别实验组对照组n 8 8甘丙肽mRNA 1.725±0.1781)0.996±0.126 GalR1 mRNA 1.494±0.2021)1.006±0.037 GalR2 mRNA 1.068±0.143 0.999±0.040 GalR3 mRNA 1.380±0.138 1.010±0.080

2.4 免疫荧光结果C-Fos阳性细胞在海马表达见图2，实验组小鼠海马C-Fos阳性细胞数较对照组增多（t＝5.061，P=0.007），见表3。

3 讨论

图2 实验组和对照组小鼠海马C-Fos阳性细胞表达。三角箭头所指红色细胞为C-Fos阳性细胞，蓝色为H oechst，染细胞核，标尺为100μm

表3 两组小鼠海马齿状回C-Fos阳性细胞数（±s）

表3 两组小鼠海马齿状回C-Fos阳性细胞数（±s）

1）与对照组比较，经独立样本t检验，P＜0.05

组别实验组对照组n 7 7 C-Fos阳性细胞数32.9±0.71)22.6±1.8

甘丙肽由29个氨基酸组成，最初是从猪体内分离出来，从问世以来被证明广泛分布于人和动物的中枢和周围神经系统[2-3]。以往的研究显示甘丙肽主要通过G蛋白偶联其受体GalR1、GalR2、GalR3发挥生物学功能。因中枢神经系统GalR3含量较GalR1和GalR2少[7]，故在中枢神经系统中GalR1和GalR2起主要作用。在本研究中，采用原位杂交技术探索甘丙肽及其受体在雌性C57BL/6J小鼠海马的分布情况，结果显示甘丙肽及GalR1和GalR2主要分布在腹侧海马的Hilus区，GalR3原位杂交未见阳性信号。原位杂交结果为接下来研究甘丙肽系统参与调节压力相关性精神障碍奠定了基础。但所选用的小鼠未到成年期，在原位杂交脑片上可能显示的甘丙肽及其受体mRNA比成年鼠相对多，鉴于这部分实验仅用于观察甘丙肽及其受体在海马有无分布及分布范围，而不做量化比较，故实验结果影响不大。

在动物实验中，CUMS模型是用于研究压力相关性精神障碍疾病的常用且比较成熟的动物模型，本研究连续给予雌性 C57BL/6J成年小鼠 4周CUMS刺激后，糖水偏好实验中实验组小鼠对糖水的饮用量减少，存在抑郁样行为。新物体识别实验中，实验组小鼠对新物体的探索时间百分比缩短，提示实验组小鼠存在短时工作记忆障碍，这与目前焦虑抑郁样行为小鼠存在学习记忆减退的研究结果相一致[8]。在旷场实验中实验组小鼠在中间区域停留时间短，表明实验组小鼠存在焦虑样行为。悬尾实验中实验组小鼠静止不动时间延长，存在放弃挣扎的抑郁样行为。上述行为实验结果表明实验组小鼠存在焦虑抑郁样行为，为进一步探索甘丙肽系统在焦虑抑郁样小鼠海马中表达情况提供了可靠的动物模型。

qPCR结果显示实验组小鼠海马的甘丙肽及GalR1 mRNA表达量增高，结果与文献报道一致[6]，表明甘丙肽及GalR1有促进焦虑、抑郁样行为的作用。NARVAEZ等[4]报道GalR2有抗抑郁作用，而本实验中GalR2 mRNA在焦虑抑郁样行为小鼠海马的表达量未见改变，推测GalR2在本实验所采用的实验模型中拮抗抑郁作用不明显。GalR3被认为与GalR1一样通过激活抑制性G蛋白Gi/ Go通路发挥生物活性作用[9]，在焦虑抑郁样雌性小鼠中GalR3 mRNA表达有增高的趋势，但与对照组差异无统计学意义。研究显示C-Fos细胞是一种压力相关的细胞，其阳性细胞数的改变可受压力及药物的调节或诱导[10]。同时，也有研究显示，在小鼠脑内杏仁核区域定位注射甘丙肽及GalR1激动剂，可使该区域的C-Fos阳性细胞数明显增加[11]。结合本研究实验组小鼠海马的C-Fos阳性细胞数较对照组明显增加，推测甘丙肽及GalR1表达增加可能对海马齿状回C-Fos阳性细胞数的增多有促进作用。

本研究初步明确雌性C57BL/6J小鼠海马中甘丙肽及GalR1增加与焦虑抑郁行为有关，与海马C-Fos表达增多可能也有关。研究主要不足之处在于缺乏给予甘丙肽或GalR1抑制剂反向验证上述实验结果，希望在以后的研究中能够得以弥补。

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The expression and function of galanin system in the hippocampus of anxiety-and depression-likebehavior female mice.

CHEN Guoyan,YANG Weiyi,HU Xiaohui,ZOU Huili,LEI Gesheng,SU Changjun. Department of neurology,Tangdu hospital,The Fourth Military Medical University,Xian 710038,China.Tel:029-84777643.

ObjectiveTo explore the expression and function of galanin and its receptor in the female mice of anxiety-and depression-like behavior.MethodsIn situ hybridization was used to detect the expression of galanin, GalR1,GalR2 and GalR3 in the hippocampus of C57BL/6J female mice.A total of thirty female mice was divided into two groups:experiment group (n=15)and control group (n=15).The experiment group was subjected to the chronic unpredictable mild stress(CUMS)for four weeks,and the control group was not subjected to any treatment.Four weeks later,a series of tests were performed on those two groups,including the sucrose preference test,the novel object recognition test,the open field test and suspension tail test.After behavior tests,the hippocampus RNA was extracted from eight mice in each group to test the expression of galanin and its receptor through qPCR.The rest part of mice wereused to mark C-Fos immunostaining in the dentate gyms (DG)of hippocampus.ResultsThe result of in situ hybridization showed that galanin,GalR1 and GalR2 distributed in the Hillus of ventral hippocamous,GalR3 had no positive signal.In the sucrose preference test,the experiment group drunk less sucrose when compared with the control group(P＜0.05).In the novel object recognition test,the experiment group contacted shorter time to the novel object when compared with the control group (P＜0.05).In the open field test,the experiment group had shorter in session time when compared with the control group (P＜0.05).In the suspension tail test,the experiment group had longer immobility time when compared with the control group(P＜0.05).The qPCR result showed that the higher expression of galanin and GalR1 in the hippocampus of experiment group (P＜0.05).More C-Fos positive cells in the DG of hippocampus of experiment mice were immunostained (P＜0.05).ConclusionsGalanin,GalR1 and GalR2 mainly distribute in the Hillus of the ventral hippocampus.Galanin may be involved in the anxiety-and depression-like behavior of C57BL/6J through GalR1.

Galanin Galanin receptor Chronic unpredictable mild stress in Situ Hybridization

R749.4

A

2017-02-22）

（责任编辑：肖雅妮）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.07.003

☆国家自然科学基金（编号：31371094）

* 第四军医大学附属唐都医院神经内科（西安 710038）