鼻炎灵片中马兜铃酸Ⅰ的限量检测

张红梅

(济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102)

鼻炎灵片中马兜铃酸Ⅰ的限量检测

张红梅

(济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102)

目的：通过萃取、过固相萃取小柱提取鼻炎灵片中的马兜铃酸Ⅰ，并用高效液相色谱法进行限量测定。方法：采用Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相：0.3%碳酸铵溶液（用20%盐酸溶液调pH至7.5）-乙腈（80∶20），检测波长：250 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：35℃，进样量：20 μL。结果：马兜铃酸Ⅰ在0.006 739～0.1348 µg/mL浓度范围内，马兜铃酸Ⅰ色谱峰的峰面积与对照品浓度线性关系良好（r＝0.999 6，n＝5）；最低检测限为0.16 ng/mL（信噪比为3∶1）；平均回收率为92.0%，RSD为1.8%（n＝6）。结论：经过本法测定，鼻炎灵片中未检出马兜铃酸Ⅰ。

马兜铃酸Ⅰ；鼻炎灵片；高效液相色谱法；限量检测

鼻炎灵片为炒苍耳子、辛夷、白芷、细辛等8味中药配伍组成，具有透窍消肿，祛风退热的功效，在临床上用于慢性鼻窦炎、鼻炎及鼻塞头痛，浊涕臭气，嗅觉失灵等。方中细辛含有微量的马兜铃酸Ⅰ，马兜铃酸Ⅰ为硝基菲羧酸类成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等作用，但同时又具有蓄积毒性，长期或过量服用易导致严重的肾毒性，表现为急、慢性马兜铃肾病、肾小管功能障碍等[1-3]。2004年8月，为保证人民群众的用药安全，国家食品药品监督管理局根据对含马兜铃酸药材及其制剂不良反应的报道以及毒副作用研究结果的分析，决定加强对含马兜铃酸药材及其制剂的监督管理。为了更有效地控制鼻炎灵片的质量，保证临床用药安全，本文采用高效液相色谱法对鼻炎灵片中可能含有的马兜铃酸Ⅰ，进行限度检查，为其在临床中的合理应用提供参考和依据。

1 仪器与试剂、试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（1260VWD紫外检测器，安捷伦公司；二极管阵列检测器，岛津公司）；Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；MS105DU电子分析天平（梅特勒公司），KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂

马兜铃酸Ⅰ对照品（批号：110746-201510，含量：99.1%，中国食品药品检定研究院），鼻炎灵片（河南润弘本草制药有限公司，批号：140801，140803，140805，140808，规格：0.3 g/片；山西华康药业股份有限公司，批号：20150702，20150801，2010805，规格：0.3 g/片；天津同仁堂集团股份有限公司，批号：FP01002，FP01003，FP01006），碳酸铵为分析纯（天津市大茂化学试剂厂），乙腈、甲醇均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），水为普利斯纯净水，其他试剂均为分析纯。4.6 mm，5 μm）；流动相：0.3%碳酸铵溶液（用20%盐酸溶液调pH至7.5）-乙腈（80∶20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：35℃；进样量：20 μL。结果见图1。

2 溶液的制备

2.1 对照品溶液

取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含67.388 µg的溶液，作为储备液，放入冰箱保存。

2.2 供试品溶液

取样品60片，研细后，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇150 mL，密塞，称定质量，超声（功率500 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，至分液漏斗中，加浓氨溶液5 mL，用三氯甲烷提取3次，每次40 mL，弃去三氯甲烷层，碱液层用20%盐酸溶液调节pH至2～3，再用三氯甲烷提取4次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，至蒸发皿中，水浴挥干，残渣加甲醇5 mL分次使溶解、洗涤，加至依次用甲醇、水、甲醇各2 mL预洗的Bond Elut-SAX（Agilent，100 mg， 3 mL）固相萃取小柱上，依次用水、甲醇冲洗至洗涤液无色，弃去洗涤液，再用8%甲酸-甲醇溶液（8→100）4.5 mL洗脱，收集洗脱液至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性对照溶液

照处方制备不含细辛的阴性对照，再按供试品溶液项下的方法处理，即得。

3 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×

图1 鼻炎灵片中马兜铃酸Ⅰ含量的高效液相色谱图

4 方法学考察

4.1 线性关系考察

精密吸取马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液溶液（67.388 µg/mL）1.0 mL至l00 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，再用此溶液依次稀释100，50，25，10，5倍，得系列浓度溶液，按上述液相色谱条件进样20 μL，测得马兜铃酸Ⅰ的标准曲线：

A＝10 697C－19.778，

相关系数：r＝0.9996（n＝5），即马兜铃酸Ⅰ在0.006 739～0.134 8 μg/mL范围内，峰面积（A）与对照品浓度（C）线性关系良好。

4.2 检测限测定

按上述色谱条件，精密吸取马兜铃酸对照品溶液（0.134 μg/mL）用甲醇稀释进样，结果表明：当马兜铃酸Ⅰ色谱峰的信噪比S/N约为3时，马兜铃酸Ⅰ浓度为0.16 ng/mL。

4.3 定量限测定

按上述色谱条件，精密吸取马兜铃酸对照溶液（0.134 μg/mL）用甲醇稀释进样，结果表明：当马兜铃酸Ⅰ色谱峰的信噪比S/N约为10时，马兜铃酸Ⅰ浓度为0.53 ng/mL。

4.4 精密度试验

照上述的液相色谱条件，精密吸取马兜铃酸Ⅰ对照品溶液（0.0674 μg/mL）20 μL，注入液相色谱仪，连续测定6次，结果马兜铃酸Ⅰ色谱峰的峰面积RSD（n＝6）为0.9%，表明该方法仪器的精密度良好。

4.5 稳定性试验

精密吸取马兜铃酸Ⅰ对照品溶液（0.067 4 μg/mL），分别在0，1，2，4，8，12，24，48 h，照上述的液相色谱条件进样，结果马兜铃酸Ⅰ色谱峰的峰面积RSD（n＝8）为4.5%，表明对照品溶液中马兜铃酸Ⅰ在48 h内保持稳定。

4.6 样品测定

按照“2.2”项方法制备3个厂家的10批鼻炎灵片供试品溶液，按上述的液相色谱条件进行测定，结果均未检出马兜铃酸Ⅰ。

4.7 加样回收率试验

精密吸取河南润弘本草制药有限公司，批号为140803的样品滤液6份各25 mL，分别精密加入对照品溶液（马兜铃酸Ⅰ浓度为0.482 8 μg/mL）1 mL，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按上述的液相色谱条件进行测定，用外标法计算回收率。结果供试品中马兜铃酸Ⅰ平均回收率为92.0%，RSD为1.8%，表明该测定方法测定结果准确。

5 讨论与总结

5.1 结合文献报道[4-5]及在二极管阵列检测器下的测定，选择了250 nm测定波长，在这个波长下，杂质峰相对比较少，而且检出限相对比较高；并采用基线噪声小，灵敏度高，峰形良好，与其他成分能达到基线分离的流动相0.3%碳酸铵溶液（用20%盐酸溶液调pH至7.5）-乙腈（80∶20）。

5.2 鼻炎灵片为中药复方制剂，成分复杂，且马兜铃酸Ⅰ含量较低，共存组分干扰多，按照文献[6-9]本文采用样品经70%甲醇超声提取，滤液经过酸碱处理、萃取浓缩后再经固相小柱进一步提纯、富集。试验中用两种固相萃取小柱Bond Elut Plexa（Agilent，60 mg, 3 mL）和Bond Elut-SAX（Agilent ，100 mg，3 mL），结果经液相测定样品溶液及回收率发现，前者的杂质峰较少，但回收率只有50%左右，后者相对杂质峰多，但不影响马兜铃酸Ⅰ的测定，且回收率能达到100%，而单独用三氯甲烷酸碱提取后，杂质峰明显比过固相小柱要多，且在马兜铃酸Ⅰ出峰位置基线不平。

5.3 由于是处方药难以购得大量样品进行检测，只进行了10批样品的检测，经过本试验，3个厂家的10批样品均未检出马兜铃酸Ⅰ，可见只要按规定规范的制剂过程，鼻炎灵片不会含马兜铃酸Ⅰ，临床使用是安全的。

[1] 陈娅娟,吴俏银,叶惠兰,等.马兜铃酸毒理研究进展[J].广东药学院学报,2003,19(2):156-157.

[2] 陈孟兰,朱正兰.马兜铃属植物的生物活性和药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2007,18(3):702-704.

[3] 许海燕,王旭.马兜铃酸肾病防治研究进展[J].中国实用内科杂志,2015,35(1):74-76.

[4] 杜晓曦,周跃华,路金才,等.RP-HPLC法测定马兜铃酸含量方法的优化[J].中国中医药信息杂志,2007,14(7):47-49.

[5] 田梦,瞿俊勇,马慧,等.马兜铃酸检测技术的研究进展[J].湖南农业科学,2015,45(2):147-149.

[6] 唐秀玲,何颂华,谢谭芳.SPE-HPLC法测定消肿止痛酊中马兜铃酸A的含量[J].药物分析杂志,2012,32(9):1690-1693.

[7] 周雪红,李志浩,陈银华,等.SPE-HPLC法测定麻黄止嗽丸中马兜铃酸A的含量[J].中医药导报,2015,22(14):44-46.

[8] 陈娜娜,李彦超,宋汉敏,等.SPE-HPLC法测定辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量[J].中医研究,2014,27(1):72-74.

[9] 薛利华.乳没镇痛胶囊中马兜铃酸的含量测定研究[J].陕西中医,2015,36(4):492-493.

本文编辑：鲁守琴

Limited Determination of Aristolochic Acid Ⅰ in Biyanling Tablet

Zhang Hong-mei
(Jinan Center for Food and Drug Control, Jinan city, Shandong Jinan 250102,China)

Objective：To establish a HPLC method for detecting the content limit of aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet. Methods：The content limit of aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet was determined by HPLC on a Shim-pack VP-ODS column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with the column temperature at 35℃. The mobile phase was 0.3% ammonium carbonate solution (pH was adjusted to7.5 with 20% hydrochloric acid) - acetonitrile (80∶20, V/V). The detection wavelength was set up at 250 nm. The fow rate was set at 1.0 mL/min, and the injection volume was 20 μL. Results：The determination of aristolochic acid Ⅰ kept the good linearity relation in the content range of 0.006 739 μg/mL～0.134 8 μg/mL (r＝0.999 6, n＝5), the limit of detection was 0.16 ng/mL (SNR of 3∶1), the mean recovery rate was 92.0%, and the RSD was 1.8% (n＝6). Conclusion：Aristolochic acid Ⅰ in biyanling tablet cann’t be determined out.

Aristolochic Acid Ⅰ; Biyanling Tablet; HPLC; Content Limit Determination

R286

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.020

2017 - 04 - 07

张红梅，女，硕士，主管药师。研究方向：药品检验及质量标准研究。E-mail：zhhm3a@sina.com.cn