RP-HPLC测定助孕丸中两种蒽醌类成分的含量

刘菊，白明学，张红伟，董玉珍

（1．郑州市中医院制剂室，河南 郑州 450007；2．郑州市食品药品检验所，河南 郑州 450007）

RP-HPLC测定助孕丸中两种蒽醌类成分的含量

刘菊1，白明学1，张红伟2，董玉珍2

（1．郑州市中医院制剂室，河南 郑州 450007；2．郑州市食品药品检验所，河南 郑州 450007）

目的：建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定助孕丸中两种蒽醌类成分的含量。方法：采用RP-HPLC进行测定，以Angilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇∶0.1%磷酸溶液（85∶15）为流动相，流速：1.0 mL/min，检测波长：254 nm。结果：结果大黄素、大黄酚分别在0.026 8～0.134 μg，0.064 6～0.322 8 μg范围内线性关系良好（r＝0.999 9，0.999 9），平均回收率分别为100.4%，99.8%。结论：该方法简便、快速、准确，可有效地控制助孕丸中两种蒽醌类成分的含量。

RP-HPLC；助孕丸；大黄素；大黄酚

助孕丸是由大黄、桃仁、枳壳、细辛等7味中药制备而成的院内制剂，具有活血化瘀，补肾温经的功效。用于排卵功能障碍，黄体功能不全，月经失调。目前助孕丸的质量标准比较落后，无含量测定项，为了有效控制本制剂质量，本研究建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）同时测定两种蒽醌类成分（大黄素、大黄酚）的含量，现报道如下。

1 仪器、试剂和药品

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津仪器设备有限公司），ME204电子分析天平（梅特勒-托利多称重系统设备有限公司）。

1.2 试剂

大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，含量以98.7%计，批号：111756-201512），大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，含量以100.0%计，批号：111796-200716），甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.3 药品

助孕丸[批准文号：豫药制字Z20130199（郑），郑州市中医院制剂室生产，批号：160527，160807，161203]药物组成：大黄、桃仁、枳壳、细辛、沉香、紫豆蔻、木香。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1-4]

色谱柱Angilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇∶0.1%磷酸溶液（85∶15），流速：1.0 mL/min，检测波长：254 nm，柱温为室温。

2.2 对照品溶液的制备

取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL含大黄素5.36 μg、大黄酚12.91 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备[5-8]

取研细后的样品约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，用乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，蒸干，加30%乙醇-盐酸（10∶1）的混合溶液15 mL，置水浴中加热回流1 h，立即冷却，用三氯甲烷强力振摇提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）的混合溶液溶解，转移至25 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性溶液的制备

取缺大黄的阴性制剂约1 g，精密称定，按照“2.3”项下供试品溶液方法制备。

2.5 系统性试验

按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性制剂溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱峰。理论板数按大黄素峰计＞2000，分离度＞1.5，阴性无干扰，见图1。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 取“2.2”项下对照品混合溶液，分别精密吸取5，10，15，20，25 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积（mAU）为纵坐标绘制标准曲线，得大黄素、大黄酚回归方程分别为：

Y＝2832.1X＋105，r＝0.999 9；

Y＝4560.8X＋397.5，r＝0.999 9。

结果表明大黄素、大黄酚在0.0268～0.134 μg和0.0646～0.3228 μg范围内线性良好。

2.6.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积，大黄素、大黄酚RSD分别为0.11%，0.21%，说明仪器精密度良好。见表1。

图1 系统性试验色谱图

表1 精密度试验

2.6.3 重复性试验 取样品（批号：160527）6份，按“2.3”项下方法制备，分别进样10 μL，记录峰面积，计算大黄素、大黄酚含量，结果RSD分别为1.4%，0.56%，说明重复性较好。见表2。

2.6.4 日内稳定性试验 精密吸取供试品溶液（批号：160527），分别在0，2，4，6，8，12 h按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录大黄素、大黄酚峰面积，RSD分别为0.13%，0.16%，表明溶液在12 h内稳定，见表3。

2.6.5 加样回收率试验 取已知含量的样品（批号：160527）10份，每份0.5 g，精密称定，分别加入大黄素、大黄酚，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算回收率，结果平均回收率为100.4%，99.8%，RSD分别为0.47%，0.44%，结果见表4，表5。

2.7 供试品含量测定

取助孕丸三批，按照“2.3”项下方法制备，分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标一点法计算供试品中两种蒽醌类成分含量，结果见表6。

表2 重复性试验

表3 日内稳定性试验

表4 大黄素加样回收率试验

表5 大黄酚加样回收率试验

表6 样品测定结果

3 讨论

3.1 最大吸收波长确定

实验中，将一定浓度两种蒽醌类成分对照品溶液加甲醇溶解稀释至合适浓度，用紫外分光光度计在200～400 nm范围内进行波长扫描，结果在254 nm处有最大吸收，因此波长确定为254 nm。

3.2 流动相、流速确定

参照《中华人民共和国药典》（2015年版）及相关文献[9-14]，选择甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水3种系统作为流动相调试，结果，甲醇-0.1%磷酸水出峰效果较好，然后甲醇-0.1%磷酸水不同比例进行调试，甲醇∶0.1%磷酸水比例在（85∶15）时供试品溶液中两种蒽醌类成分峰分离良好，且阴性无干扰，由此试验确定流动相比例为甲醇∶0.1%磷酸水（85∶15）。将流速分别调为0.8，1.0，1.2 mL/min，结果1.0 mL/min，分离度、保留时间均较好，流速定为1.0 mL/min。

本文首次建立高效液相色谱法同时测定助孕丸中两种蒽醌类成分含量，为今后质量控制提供参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版)一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:23,494.

[2] 方既明,章怀奋.高效液相色谱法同时测定麻仁丸中大黄素、大黄酸、大黄素甲谜、芦荟大黄素的含量[J].中南药学,2011,9(5):342-346.

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本文编辑：鲁守琴

Content Determination of Two Anthraquinones in Zhuyun Pills by RP-HPLC

Liu Ju1, Bai Ming-xue1, Zhang Hong-wei2, Dong Yu-zhen2
(1. Drug Preparation Room, Zhengzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Henan Zhengzhou 450007,China ; 2. Zhengzhou Institute for Food and Drug Control, Henan Zhengzhou 450007,China)

Objective：To establish a method of RP-HPLC which determinate the content of two anthraquinones in zhuyun pills. Methods：The RP-HPLC was adopted to determinate and the Angilent C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm)was chosen as chromatographic column. The mobile phase set as methanol∶0.1% phosphoric acid (85∶15). The fow rate was 1.0 mL/min and using 254 nm as detection wavelength. Results：The linear relationship of emodin and chrysophanol was good (r＝0.999 9, 0.999 9), which between 0.026 8～0.134 μg or 0.064 6～0.322 8 μg, respectively. The average recovery was 100.4% and 99.8%, respectively. Conclusion：This method is simple, fast and accurate, which can effectively control the content of two anthraquinones in zhuyun pills.

RP-HPLC; Zhuyun Pills; Emodin; Chrysophanol

R917

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.019

2017 - 04 - 20

河南省中医药科学研究专项课题（编号：2015ZY02077）

刘菊，女，硕士，主管药师。研究方向：中药制剂、药物分析。通讯作者E-mail：61843889@qq.com