栽培环境对铁皮石斛生长与代谢成分的影响

2017-09-09林弋凯朱玉球斯金平秦郞诸燕吴令上刘京晶��

中国中药杂志 2017年16期

林弋凯朱玉球斯金平秦郞诸燕吴令上刘京晶 ��

[摘要]為明确栽培环境对铁皮石斛的生长及代谢成分的影响，对铁皮石斛C13品系在岩壁附生、梨树附生和设施盆栽3种栽培环境下进行形态特征、显微结构、多糖和浸出物含量的观察与分析。结果表明，生长环境显著地影响铁皮石斛的生长，在农艺性状上，岩壁附生和梨树附生的铁皮石斛叶片稀少、颜色由绿变紫红、伸展角度减小，茎秆多呈紫色、较粗壮，茎长分别为34，40 cm，普遍比设施盆栽（75 cm）短，且根系特别发达；在显微结构上，野外生长的铁皮石斛与设施栽培比均表现出叶片增厚、上表皮厚度增加、下表皮表皮毛丛生、气孔小而密，根被细胞、外皮层、内皮层的细胞壁均偏厚，且根被、外皮层、内皮层、髓部的细胞小且排列紧密，但栽培环境没有产生特异性的组织结构，主要是结构参数大小和数量的变化，说明铁皮石斛具有很好的环境适应能力；此外，生长环境显著地影响铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物等代谢成分的积累，岩壁附生铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量最高，质量分数分别达3734%，1166%，梨树附生次之，质量分数分别为3390%，962%，均高于设施盆栽；通过HPLC分析，岩壁附生铁皮石斛中醇溶性浸出物成分比另外2种栽培模式更加复杂，说岩壁附生栽培环境更有利于铁皮石斛次生代谢产物的合成和积累。

[关键词]铁皮石斛；栽培环境；形态特征；显微结构；代谢成分

Effects of cultivation environments on Dendrobium catenatum

LIN Yikai1， ZHU Yuqiu2， SI Jinping1*， QIN Lang2， ZHU Yan3，WU Lingshang1， LIU Jingjing1

（1State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University， Lin′an 311300， China；

2 Anhui Mulongshan Ecotourism Development Co， Ltd， Quanjiao 239500， China；

3Hangzhou Zhenheng Biotechnology Co， Ltd， Lin′an 311300， China）

[Abstract]The study was aimed to clarify the effect of three cultivation environments on the growth and metabolism of Dendrobium catenatum C13 group There were three different cultivation conditions including rock epiphytic cultivation， pear epiphytic cultivation and pot cultivation Morphological characteristics and agronomic characters of D catenatum were observed and measured Microstructure， contents of polysaccharide and alcoholsoluble extracts were measured by paraffin section method， phenolsulfuric acid method and hotdip method， respectively The result showed that the cultivation environment significantly affected the growth of D catenatum， the leaves of D catenatum that cultivated on the rock and pear were sparse and small， the stems were short and purple and the root system was developed Compare with potted cultivation， D catenatum from rock epiphytic cultivation and pear epiphytic cultivation showed the following characteristics in the microstructure： the upper epidermis became thicker， the epidermal hair in the epidermis became denser， stomatal showed smaller and denser， the cell wall of exodermis， endoderm and medulla became thicker， the cell of velamen， exodermis， endoderm and medulla were smaller and arranged more closely， but the cultivation environment did not produce specific tissue structure， mainly changed in the structural parameters of size and quantity The growth environments also influenced contents of polysaccharides and alcoholsoluble extracts The dontents of polysaccharides and alcoholsoluble extracts in D catenatum from rock epiphytic were the highest， reached 3734% and 1166%， the second was pear epiphytic， both higher than pot cultivation， alcoholsoluble extracts contents in D catenatum from rock epiphytic are more complex， which shows that rock epiphytic is conducive to the accumulation of secondary metabolites in D catenatumendprint

[Key words]Dendrobium catenatum； cultivition environment； morphological characteristics； microstructure； effective components

铁皮石斛Dendrobium catenatum （D officinale）是我国传统名贵中药材，具有增强免疫力、抗肿瘤、滋阴清热、益胃生津等功效[13]。因过度采挖与生境破坏，野生铁皮石斛资源已近枯竭。进入新世纪以来，随着栽培技术不断突破，铁皮石斛产业发展迅猛，不同栽培模式应运而生[46]，栽培模式对铁皮石斛生长与产品质量的影响成为关注的热点。本文用铁皮石斛C13品系，开展了设施盆栽、岩壁附生、活树附生（梨树）3种环境下外观形态、显微结构、代谢成分的变异规律的研究。

1材料与方法

11供试样品

栽培品种為本课题组选育的铁皮石斛C13品系[7]，2012年11月采集种子，在浙江农林大学组培室无菌播种，2013年8月瓶苗移栽到设施大棚驯化种植。2015年3月将大棚种植苗分别移栽至花盆、岩壁、梨树栽培，进行统一的管理。

12仪器与试剂

UV2550紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；D37520快速离心机（德国Heraeus公司）；MilliQ Academic超纯水仪（美国Millipore公司）；Leica荧光显微镜（DM4000）；无水乙醇和苯酚均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。碘和碘化钾购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

13试验地概况

试验地位于浙江省临安市天目山镇横塘村麻泥角弄（东经119°26′11″，北纬30°20′30″，海拔280 m），系铁皮石斛自然分布区的北缘，常年年均气温164 ℃，其中2016年最高温达37 ℃、最低温达-10 ℃，降水日158 d，无霜期237 d，受寒潮、台风等极端天气的影响。

14栽培环境

141设施盆栽设施塑料薄膜连拱大棚高55 m，长宽均为40 m，遮阳率50%，2015年3月种植，塑料花盆上口直径15 cm，高13 cm，摆放在高90 cm的移动苗床上，以松树皮为基质，厚度为9～11 cm。种植平面2016年1月平均温度达70 ℃，最低温达-73 ℃；2016年7月平均温度达293 ℃，最高温达431 ℃。在铁皮石斛的生长季节，晴天每天喷雾1～2 h，当铁皮石斛越冬期时，每隔2～3 d喷雾1次，夏季加强棚内通风，减少病害的发生。

142岩壁附生2015年3月种植在高为2 m的90°的岩壁上，种植密度20 cm×20 cm，采用包装带固定至2015年9月，试验地上方无遮挡物，栽培过程中不用任何基质，不施加任何肥料。种植后生长季节晴天每天喷雾1～2 h，通过水分调控改善环境的湿度与温度，2016年1月岩壁附生栽培环境平均温度为44 ℃，最低温达-148 ℃；2016年7月平均温度达300 ℃，最高温达481 ℃。

143梨树附生以梨树为活树附生的载体，2015年3月将铁皮石斛附生于树龄20年左右梨树的树干、树枝、树杈上，用梨树的树木枝叶进行遮阴，用麻绳绑住铁皮石斛的根茎处，间隔30 cm捆1层，层内丛距8～10 cm，种植后生长季节晴天每天喷雾1～2 h。2016年1月梨树附生栽培环境平均温度为39 ℃，最低温达-136 ℃；2016年7月平均温度达298 ℃，最高温达443 ℃。

15外观形态与显微结构观察

2016年4月分别测定设施盆栽、岩壁附生、梨树附生3种环境铁皮石斛各个生理年龄的萌糵数量、茎节数，用直尺和数显游标卡尺分别测量二年生、三年生萌糵的茎高和茎粗，测定二年生萌糵的叶片数量、叶片长度、叶片宽度、茎粗，5株为1组，重复3次。

采用常规石蜡切片法观测叶片与根的显微结构[8]，2016年8月分别采集3种环境铁皮石斛叶片（从上向下数第4片叶）和根（距离根尖2～5 cm处），制作石蜡切片，采用番红固绿复染法分别对材料进行染色，中性树胶封片，Leica荧光显微镜进行观察、拍照。

采用气孔保卫细胞染色体计数法方法观测叶片气孔的变化 2016年10月分别采摘铁皮石斛叶片（从上向下数第4片叶），迅速放入装有固定液（无水乙醇冰乙酸3∶1）的样品瓶中，静置至叶片褪色发白；将褪色的叶片剪成上、中、下三等分，取中部的叶片置于无菌水中，浸泡约3 min后取出，置于载玻片上，用1%碘碘化钾溶液染色，盖上盖玻片后立即用Leica荧光显微镜观测叶片的下表皮[9]。3个环境各设立3个重复，用Leica荧光显微镜在每张玻片中随机采集5张图片。用显微镜中的标尺测量每张图片中每个气孔保卫细胞的长度、宽度和气孔个数，用椭圆的周长近似公式计算叶片气孔及2个保卫细胞组成整体的外周周围长（L）[10]。用SPSS 180软件处理数据，并进行方差分析，标注显著性差异结果。

16代谢成分分析

2016年4月25日分别采集3种栽培环境的铁皮石斛二年生和三年生萌条，每个栽培环境采样不少于25个萌条，每丛植株各采集1条二年生和三年生萌条，重复3次。将采集的样品茎叶分离，100 ℃杀青后，置于60 ℃烘箱内烘至恒重，粉碎过60目筛后保存于干燥器中待用。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，根据2015年版《中国药典》（一部）附录ⅤA项下的热浸法测定醇溶性浸出物含量。3种环境茎醇溶性成分参照朱波等的方法[11]。

2结果与分析

21栽培环境对铁皮石斛形态特征与农艺性状的影响

铁皮石斛C13在设施盆栽、岩壁附生、梨树附生3种环境中均能正常生长发育，但环境条件对形态特征与农艺性状影响十分明显（表1）。

从表1可见，3种环境的茎秆长度差异明显，设施盆栽的二年生平均株高75 cm，明显高于梨树附生和岩壁附生的34，40 cm，3种环境茎粗没有显著差异；设施盆栽叶片繁茂且颜色呈深绿色，茎秆呈浅绿色，岩壁附生和梨树附生叶片稀少，叶片长和宽明显小于设施盆栽，二年生茎秆和叶片的颜色多呈紫红色，说明设施栽培的遮阳功能有利于茎秆的高生长，岩壁附生和梨树附生因阳光直射影响叶片色素的合成与比例大小。endprint

3种环境的根系分布存在显著差异：设施盆栽根系直立向下，多数扎在基质之中；岩壁附生的根系特别发达，根系呈扁平状、无吸盘，紧贴着岩壁向四周发散，根系偶有分叉；梨树附生的根系多数弯曲的扎入梨树树皮中，体现了铁皮石斛根对3种环境的生态适应性（图1）。

22栽培环境对铁皮石斛显微结构的影响

221栽培环境对叶的影响铁皮石斛的叶片由表皮、叶肉和叶脉3部分组成，3种不同环境的铁皮石斛叶的上、下表皮均有1层近方形的生活细胞组成，上表皮细胞略大于下表皮细胞，上表皮无表皮毛、下表皮表皮毛丛生。气孔仅分布于下表皮，不同栽培环境下叶片解剖结构主要参数存在显著差异（表2）。

从表2可见，大棚栽培的气孔长、外周长平均达到3625，13750 μm，均极显著高于岩壁栽培和梨树附生，而3个栽培环境之间的气孔宽差异不显著。梨树附生、岩壁附生、大棚栽培的气孔密度分别每平方毫米为10235，7053，5348个，三者存在极显著差异。气孔密度与外周长呈现负相关关系，气孔外周长越大，气孔密度就越小（图2）。为适应野外强光和干旱环境，气孔密度明显增大、气孔周长减小。

3种栽培环境的铁皮石斛叶肉均没有明显分化为海绵组织和栅栏组织，岩壁附生和梨树附生的叶片厚度、叶肉厚度、上表皮厚度均显著大于大棚栽培

从图4可见，生长于3种环境的铁皮石斛根的根被细胞层数不同。梨树附生和岩壁附生的铁皮石斛根被细胞层数为3～4层，而大棚栽培的根被细胞层数为3～7层、排列不规则，且最外层多了一层排列紧密的生活细胞；岩壁附生和梨树附生的细胞壁明显加厚，且岩壁附生的细胞壁表现为最厚。大棚栽培的铁皮石斛根被层里的细胞大、排列疏松；岩壁附生和梨树附生的根被层里的细胞小且排列紧密，且在根与岩壁或梨树的接触面的细胞表现的最为明显。

3种环境铁皮石斛的外皮层均由一层径向延长、排列紧密的马蹄形细胞组成且细胞壁加厚，中间偶尔夹杂着几个近方形的通道细胞，是植物养分和水分的交换通道。但大棚栽培的外皮层细胞较岩壁附生和梨树附生的细胞大且排列疏松。岩壁附生和梨树附生的外皮层与大棚栽培有明显的差异，在与岩壁或梨树的接触面，外皮层细胞呈直线排列且极为紧密，而大棚栽培的地下根的外皮层整体呈类圆形，充分体现了铁皮石斛对不同环境的适应性。大棚栽培的皮层薄壁细胞均比其他环境小且排列疏松。

皮层以内，根的中心部分为中柱，由中柱鞘、维管束和髓组成。3个不同环境铁皮石斛的维管束结构有显著差异。生长于3个不同的环境，木质部的发育程度也不同，大棚栽培的木质化程度最高，占中柱的比例最大。

23栽培环境对铁皮石斛代谢成分的影响

231栽培环境对铁皮石斛多糖和浸出物的影响多糖和醇溶性浸出物含量是铁皮石斛主要的有效成分，是评价铁皮石斛品质的主要指标，栽培环境显著地影响多糖和浸出物的含量（表3）。

从表3可见，梨树附生和岩壁附生的铁皮石斛二年生和三年生多糖和醇溶性浸出物含量均高于设施盆栽，且岩壁附生的多糖含量最高，二年生和三年生多糖質量分数分别达到3734%，3663%比设施盆栽高447%，1047%；醇溶性含量比设施盆栽高353%，263%。铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量与生理年龄密切相关，3个环境的铁皮石斛二年生多糖含量均显著高于三年生。设施盆栽、梨树附生、岩壁附生二年生多糖含量比三年生分别高661%，358%，071%。二年生和三年生岩壁附生的多糖和醇溶性浸出物总量最高，均高于设施盆栽和梨树附生。

232栽培环境对铁皮石斛茎醇溶性成分的影响通过HPLC分析，3个栽培环境的铁皮石斛茎醇溶性成分有明显差异（图5）。岩壁附生的铁皮石斛特征峰最多，达10个，其中，6，12，13，14号峰分离度较好，且是岩壁附生独有的差异特征峰，4，5，8号峰是大棚栽培特有的特征峰；1，2，3号峰为梨树附生特有的特征峰，而11号峰是生长于3种环境下铁皮石斛茎共有的特征峰，其三年生峰面积均高于二年生，说明该成分的含量随着年份的增加而累积。

3结论与讨论

生长环境显著地影响铁皮石斛的生长，野外恶劣环境下岩壁附生和梨树附生的铁皮石斛整丛植株逐渐变成紫红色，而且叶片稀少、伸展角度的减小，茎条粗壮矮小，根系特别发达，生物量明显低于设施盆栽；野生环境下的铁皮石斛在组织结构上明显不同于设施栽培，均表现出叶片增厚、上表皮厚度增强、下表皮表皮毛丛生、气孔小而密，根被细胞、外皮层、内皮层的细胞壁偏厚，且根被、外皮层、内皮层、髓部的细胞小且排列紧密，以利于增强保温作用、减少水分蒸腾、降低强光在叶肉的通量、减少强光对叶表皮的损伤、有利于提高水分利用效率、维持光合效率，体现出铁皮石斛对野外低温、强光环境的适应性。

次生代谢物质积累与环境关系密切[12]，在3种生长环境下，岩壁附生铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量最高，梨树附生次之，均高于设施盆栽。说明岩壁附生的栽培环境更有利于铁皮石斛次生代谢产物的积累；另外，岩壁附生铁皮石斛中醇溶性物质组成比另外2种栽培模式样品复杂，不同的野外环境影响植物的次生代谢途径，导致次生代谢产物组成不同。

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