基于ISSR技术和非腺毛特征研究柔毛淫羊藿和近缘种遗传关系和居群遗传多样性

刘翔 付长珍 高敏 植汉成 杨相波 郭宝林

[摘要]该研究对柔毛淫羊藿14个居群和星花淫羊藿1个居群共128个单株进行ISSR分析，用POPGENE计算相关系数，UPGMA进行聚类分析，以及用光学显微镜观察了每个居群叶背主要非腺毛类型和特点。研究发现：非腺毛可分为5个形态类别，分别为长直毛、长卷曲毛、伏卷曲毛、拟短伏毛和长伏毛；筛选出的8个ISSR引物共扩增出94个条带，其中多态性条带90个，基于ISSR聚類分析结果，15个居群分为3个分支，星花淫羊藿居群并没有单独为一支，应不能独立成种，应并入柔毛淫羊藿或者作为柔毛淫羊藿的种下等级；柔毛淫羊藿居群间遗传关系与地理分布及非腺毛特征具有良好的相关性，但也存在不一致的情况，这对于进一步研究柔毛淫羊藿以及淫羊藿属植物的种间关系和成种方式提供了良好的提示。居群多样性分析表明柔毛淫羊藿居群的基因流Nm为0354 4，Nei′s基因分化系数为0585 2，说明居群间表现出较高水平的遗传分化，主要原因可能来自柔毛淫羊藿居群自交率高和种子散布范围小。

[关键词]柔毛淫羊藿； 星花淫羊藿； 居群； 非腺毛； ISSR分子标记； 遗传多样性

Genetic relationship and population genetic diversity of

Epimedium pubescens and its related species based on ISSR and

nonglandular hair characteristic

LIU Xiang1，2， FU Changzhen1， GAO Min1， ZHI Hancheng3， YANG Xiangbo4， GUO Baolin1*

（1 Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Science， Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

2 Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065， China；

3 Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；

4Guizhou Tongjitang Pharmaceutical Co， Ltd， Guiyang 550002， China）

[Abstract]In this study， 128 individuals form 14 Epimedium pubescens populations and 1 E stellulatum population were analyzed by ISSR marker The data were calculated by POPGENE software and clustered by UPGMA method Optical microscope was used to observe the main types of the nonglandular hairs and their characteristics in each population It is found that the following conclusions： Nonglandular hairs can be divided into five morphological categories， long straight pubescent， curly pubescent， appressed curly pubescent， pseudo short appressed hairs and long appressed Eight primers were screening and a total of 94 bands were detected in ISSR， among which 90 were polymorphic bands Based on the results of ISSR cluster analysis， 15 populations were divided into 3 clades E stellulatum populations should be incorporated into the E pubescens or as avariety under E pubescens not be independent and as it has no separate phylogenetic branch for a cluster The genetic relationship among the populations of E pubescens was closely related with its geographical distribution and nonglandular hair features But there were also some inconsistency， which provided a good hint for the further study on the interspecific relationship and natural speciation manner of Epimedium species Population diversity analysis showed Nm=0354 4， Nei′s=0585 2 It was showed that E pubescens has high genetic diversity among populations， for which the main reason was probably the high inbreeding rate and the small range of seed dispersalendprint

[Key words]Epimedium pubescens； Epimedium stellulatum； populations； nonglandular hairs； ISSR； genetic diversity

柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim是小檗科淫羊藿属植物，为《中国药典》“淫羊藿”收载来源物种[1]，也是多个来源物种中资源量最大的种类。主要分布于四川盆地及其周围山系、重庆西北部和陕西南部，甘肃的最南端也有少量分布，分布的北界为陕西的太白山，南界为四川的宜宾，西界为四川的宝兴，东界为重庆的潼南。柔毛淫羊藿生于海拔300～2 000 m的灌丛中、林下，山坡或山沟荫湿处[2]。

简单重复序列区间扩增多态性标记技术（intersimple sequence repeat，ISSR）是由Zietkiewicz等[3]创建的一种分子标记，能在分子水平上提供大量的遗传信息，具有重复性好、多态性丰富、操作简单等优点；呈孟德尔式遗传，具显性或共显性特点，广泛应用于药用植物品种鉴定、遗传多样性、进化和系统发育等方面的研究中[45]。

淫羊藿属植物丰富的种间种内形态变异，复杂的种间杂交关系，是植物界中分类学和系统发育最具挑战性的类群之一[6]，用RAPD，RFLP，ITS，AFLP，iPBS，以及叶绿体全基因组等分子标记分析淫羊藿属植物的遗传关系的报道较多[610]。陈燕英等研究发现ISSR标记可很好揭示7种川产淫羊藿属种间亲缘关系[11]。本研究采用ISSR技术分析了柔毛淫羊藿及叶和花形态与柔毛淫羊藿极为相似的近缘种星花淫羊藿E stellulatum 15个居群共128个个体的遗传关系，并结合本课题组以往在植物形态和非腺毛形态方面的研究积累，分析这二者之间遗传关系，并探讨柔毛淫羊藿种下的遗传多样性和该物种的遗传结构。

1材料

11样品供试材料为野外采集后活体保存在贵州同济堂淫羊藿种质资源圃，全部由郭宝林研究员鉴定，凭证标本存放于中国医学科学院药用植物研究所（IMD）。本研究共涉及柔毛淫羊藿14个居群和近缘种星花淫羊藿1个居群（来自湖北十堰），共128个个体样品，采集时间为2011年4月，采集植株上的健康幼嫩叶片，放入装有硅胶的自封袋，干燥，备用（表1）。

12仪器Gel Doc XR凝胶成像仪（美国，BioRad），LongGeneMG96+/96 G Thermol cycle PCR仪，TG16W高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），综合纯水仪ELGAPURE Classic型（英国，ELGA），JY300电泳仪（北京君意东方电泳仪器设备有限公司），ZEISS Axio Imager A1光学显微镜（德国卡尔蔡司公司）。

DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），Taq酶（TOYOBO），Trans 2K Plus DNA Maker、dNTPs（北京金式金生物技术有限公司），琼脂糖（进口分装），其余为国产分析纯试剂。

2方法

21非腺毛观察每份样品取5片叶片，分别于叶脉中部，叶缘两侧、叶柄及叶片顶端5部分取样，置于洁净载玻片上，水合氯醛透化，稀甘油封片。样品制片后在显微镜下观察下表皮毛茸整体特征，摄影并测量统计。

22DNA 提取采用CTAB法[15]提取基因组DNA，因样品含多糖，增加了去多糖处理，即称取约30 mg干燥叶片，于液氮中研磨，将粉末转移至离心管，每管加入1 400 μL去多糖溶液，冰浴10 min、离心、弃去上清液，之后采用天根试剂盒提取基因组DNA。

23ISSR引物的筛选ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的序列设计，由北京奥科生物科技有限公司公司合成，共100条引物，从中筛选出8条扩增条带清晰、特异性条带多、反应稳定的引物用于全部15个居群128份DNA 样品ISSR分析（表2）。

24ISSRPCR扩增与检测ISSR反应体系：总体积25 μL，内含Taq酶（5 U·L-1）015 μL，10×Easy Taq DNA Polymerase Buffer（含Mg2+）25 μL，25 mmol·L-1dNTP 2 μL，引物12 μL，模板DNA 1 μL（DNA量1～2 ng），ddH2O 1815 μL。

扩增程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min（每个循环-1 ℃直到 48 ℃），72 ℃延伸1 min 50 s，需6个循环，再94 ℃ 1 min，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 50 s，34 个扩增循环； 72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

电泳条件：PCR扩增产物以15%琼脂糖凝胶检测，80 V恒压10 min，接着130 V恒压30 min，使用Bio Rad凝胶成像仪照相。

25数据的采集、统计用Bio Rad凝胶成像仪自带的Quantity One 软件，并结合人工读带。按照相同迁移位置上有扩增带记为1，无记为0，强带和弱带均赋值为1，统计得到0，1矩阵，用于数据分析。采用POP2GEN32软件对其进行分析，得到各相关参数：Nei′s基因多样度指数（H）、Shannon′s表型指数（I）、群体分化系数（Gst）、多态性条带百分率（PPB）、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、群体总基因多样性（Ht）、群体内基因多样性（Hs）、Nei′s遗传距离（D）和遗传一致度，并根据Nei′s遗传距离利用UPGMA法分析各居群间的遗传分化关系。利用NTSYS pc21对柔毛淫羊藿各个体进行聚类分析，并进一步利用AMVOA 155软件分析柔毛淫羊藿居群内和不同居群间的变异。

3结果与分析

31不同居群的非腺毛特征淫羊藿的非腺毛结构可以分为3个部分，基细胞（指非腺毛与表皮细胞相连接的细胞，一般偏小，壁薄）、伸长细胞（指基细胞与顶细胞之间，相对基细胞明显伸长的细胞，壁厚与顶细胞相同，部分情况缺）和顶细胞（末端的一个细胞，顶端尖，偶钝，壁常加厚）[12]。柔毛淫羊藿的非腺毛由基细胞和顶细胞两部分构成，顶细胞一般占毛长的80%以上（e类顶细胞占毛长的46%以上），可以分为5种类型：a类长直毛，毛长140～950 μm，直径6～25 μm，形状平直，呈剑形，顶细胞与基细胞连接无夹角，基细胞紧缩。SCQW，SCQS，SCCZ，SCQL，SCBC，SCDJY，SCQCS，SCBZ，CQTN 9个居群皆为此种类型，是柔毛淫羊藿非腺毛的主要类型；b类长卷曲毛，长390～1 250 μm，直径12～25 μm，顶细胞卷曲状，与基细胞连接无夹角，基细胞紧缩，SCLC，SCYA的样本为此种类型；c类伏卷曲毛，长410～1 220 μm，直径12～25 μm，顶细胞卷曲状，与基细胞T型相接，基细胞紧缩，SCHY的样本为此种类型；d类拟短伏毛，长120～380 μm直径175～25 μm，顶细胞与基细胞直接相接，但邻近銜接处，顶细胞发生弯曲而形成假T形相接，SCCD居群属此种类型；e类长伏毛，长350～700 μm，直径75～15 μm，基细胞为1～2个伸长细胞，顶细胞与伸长的基细胞以直角或偏斜T型相接，SXNZ居群和星花淫羊藿HBSY居群属此类型（图1）。endprint

32ISSR遗传距离和遗传一致度利用POPGENE计算了居群间Nei′s遗传距离（D）和遗传一致度（I）。D变化范围为 0111 5～0431 2，平均 0257 8，I的变化范围为0649 7～0894 5，平均 0774 3（表3），其中采自于SCDJY，SCQCS的这2个居群的I最高（0894 5），SCCD，CQTN的I最低（0649 7）。

33ISSR聚类分析基于遗传一致度，利用 UPGMA法进行聚类分析，建立15个居群柔毛淫羊藿亲缘关系树状图（图2）。15个居群的柔毛淫羊藿聚为3大类：第Ⅰ类最为复杂，包括SCQW，SCQS，SCCZ，SCQL，SCBC，SCLC，SCDJY，SCQCS，SCHY，SCBZ 10个居群；第Ⅱ类有HBSY，SXNZ，SCCD，SCYA 4个居群；第Ⅲ类为CQTN 1个居群。

利用NTSYS pc21 对所有个体进行聚类分析，结果表明共有11个居群为全部个体聚在一起，各自成为一个独立分支，如SCHY，SCQW，SCCZ，SCQL，SCBC，SCCD，SCDJY，SCQCS，CQTN，HBSY，SXNZ。另外的4个居群中，SCQS的12个个体中，9个体聚为独立一支，2个个体和SCBZ的11个体聚为一个分支；SCLC的11个个体中，5个个体单独聚在一起，离CQTN的分支比较近，另外6个聚为一支，与SCYA的3个比较近；SCBZ的13个个体中，11个个体和SCQS的2个个体聚为一支，2个个体和SCYA的1个个体聚为一支；SCYA的4个个体中，除了3个个体和SCLC的6个个体聚在一起外，还有1个个体和SCBZ的4个体聚为一支（图3）。

34不同居群的遗传多样性通过8个引物对柔毛淫羊藿14个居群和1个星花淫羊藿居群共128个个体进行ISSR分析，共检测出94个位点，其中多态性位点90个。在物种水平上，多态位点百分率（PPB）9574%，Nei′s基因多样性（H）和Shannon信息指数（I）分别是0319 7±0149 7，0483 4±0190 6。在居群水平上多态位点百分率（PPB）3617%，Nei′s基因多样性（H）和Shannon信息指数（I）分别是0129 8±0039 1，0193 5±0058 3。从各个居群来看，SCBZ，SCLC，SCQS这3个居群遗传多样性水平最高，多态位点百分率在5106%～5638%，SCDJY，SCCD，HBSY遗传多样性水平最低，多态位点在1702%～2234%，各居群的Shannon′s信息指数（I）变化趋势与多态位点一致（表4）。

35不同居群的遗传分化和基因流用POP2GEN32计算出的不同居群柔毛淫羊藿遗传变异分析结果表明，基因流Nm为0354 4。Ht为0314 2，Hs为0130 3，各个居群之间的Nei′s基因分化系数Gst=（Ht-Hs）/Ht为0585 2，即表明：在物种水平上，有4148%的遗传变异存在于居群内，而5852%的遗传变异存在于居群间。

AMVOA对各群体的分析结果，在总的遗传变异中有4435%存在于居群内，有5565%存在于居群间（表5），这一结果与Gst结果基本一致。说明柔毛淫羊藿各居群之间表现出较高水平的遗传分化。

4讨论

41柔毛淫羊藿和星花淫羊藿关系探讨星花淫羊藿E stellulatum是Stearn根据Roy Lancaster采自湖北武当山紫云庙，种植于Royal Botanic Gardens的栽培植株发表的新种，据Stearn记载，该种植物曾由Mikinori Ogisu引自四川江油。Stearn描述星花淫羊藿与柔毛淫羊藿的形态区别点在于：前者的叶片卵形，花梗密被腺毛，内萼片披针形，长约12 mm，宽约3 mm，花瓣有微瓣片，花药黄色；后者的叶片卵形、狭卵形和披针形，花梗被腺毛，内萼片披针形或狭披针形，长5～7 mm，宽15～35 mm，花瓣无基部瓣片[17]。基于本研究组的大量野外调查和多居群形态观察，柔毛淫羊藿叶片形状从狭披针形到卵形，小花梗从不被腺毛到密被腺毛，内萼片的大小、有无轻微瓣片和瓣片的长短、花药由绿色到黄色都是有过渡类型的。如四川北部江油、平武、北川、松潘等地的柔毛淫羊藿内萼片较大，长8～12 mm，宽25～4 mm，具微瓣片，叶多为狭披针形至披针形，叶背非腺毛多为直毛，花药绿色。瓣片的有无在淫羊藿属植物是重要的鉴别特征，但在小花类型的柔毛淫羊藿中，花瓣片从不明显到1 mm，再到2 mm与距等长等情况有逐渐过渡，实难合理划分界限。因此星花淫羊藿稳定区别于柔毛淫羊藿的植物形态特点只在叶片形状，而花序和花的特征，特别是星花淫羊藿种名来自于“花大如星星”的特征实际在柔毛淫羊藿的变异范围内。本文的ISSR分析支持该结果，星花淫羊藿（HBSY居群）先与柔毛淫羊藿的四川雅安SCYA这一居群聚在一起，后与陕西南郑SXNZ和四川昌都SCCD居群聚在一起，此外，从非腺毛形态看，星花淫羊藿的非腺毛和柔毛淫羊藿陕西南郑居群为一个类型，说明从花形态、遗传关系上和非腺毛特征上，星花淫羊藿都在柔毛淫羊藿的变化范围内，且与柔毛淫羊藿的陕西居群关系密切。

值得关注的是，本研究组发现分布于湖北十堰HBSY的星花淫羊藿叶片中淫羊藿苷、朝藿定A，B，C等异戊烯基黄酮类成分的含量极低或不含，而柔毛淫羊藿的所有居群此类成分含量明显且较高[18]。基于已有数据和上述研究，星花淫羊藿应不能独立成种，并入柔毛淫羊藿，或者定为一个种下等级，还待于进一步的研究。

42遗传差异和形态地理的关系分析柔毛淫羊藿主要分布于四川盆地及其周围山系，向北跨过大巴山系到达秦岭山系（即陕西南部和湖北西北部）。一般来说由于地理隔离一方面阻断了基因交流，另一方面环境差异促进了遗传的分化，所以地理距离与遗传距离呈现较好的相关性。研究得到的所有居群UPGMA聚类图（图1）在地理距离和遗传关系上有一定联系，如SCQL，SCDJY，SCQCS 3个居群地理距离较近聚在一起。其中个体聚类分析（图3）比居群聚类分析表现出更高的地理分布联系，如SCQW，SCHY聚在一起，CQTN，SCLC 5个个体聚在一起。造成个体聚类与居群聚类不一致的原因之一是SCQS，SCBZ，SCLC，SCYA 4个居群发生了分化，也就是一个居群不同个体与不同的居群发生了聚类，同样个体聚类分析与非腺毛形态的关系也更为一致，如：同样为e类长伏毛的HBSY，SXNZ聚在一起，同为b类长卷曲毛的SCLC 6个个体和SCYA 3个个体聚在一起。但是地理分化和非腺毛形态表型与遗传聚类分析还是有诸多不一致。梁琼等通过AFLP分子标记对箭叶淫羊藿E sagittatum 12个不同居群形态及遗传多样性比较研究，结果发现聚类关系与地理分布密切相关，形态聚类与遗传聚类分析还是有诸多不一致，而且形态聚类与地理分布的相关性也低于遗传聚类，表明箭叶淫羊藿形态的多样性与遗传关系之间联系的复杂性[13]；植物类群的多型现象是地理分化和生态分化的结果，但就产生变异和分化的内在机制而言，表型可塑性变化、生态宗的分化、地理宗的分化以及地理梯度的变异、染色体变异，特别是染色体多倍化、种间杂交和无融合生殖等，都是重要的因素，而且通常多少会对植物的外部形态产生影响[14]。说明柔毛淫羊藿遗传多样性的復杂性，除了常见的地理距离和形态多样性以外，可能与柔毛淫羊藿与同属其他物种杂交的结果，如SCCD居群出现拟短伏毛与箭叶淫羊藿和粗毛淫羊藿常见的短伏毛比较类似，是SCCD居群独立进化而来还是与箭叶淫羊藿或粗毛淫羊藿发生了杂交而来，值得进一步研究。endprint

43不同居群非腺毛与遗传关系的联系非腺毛是由植物表皮细胞特化而成的突起物，其显微结构特征可因为植物种类不同而有相当大的变化，不少研究表明，非腺毛形态可作为物种分类的重要依据[15]。前人对淫羊藿属植物植物非腺毛进行了研究，认为淫羊藿属植物叶背非腺毛结构特征专属性强，在种间存在差异，具有分类学价值[16]。但多数研究针对某一种类只进行了1个或少数几个居群的研究，没有进行多个居群的研究，笔者通过对多个居群淫羊藿属植物非腺毛研究发现，分布范围广的物种如箭叶淫羊藿E. sagittatum、天平山淫羊藿E. myrianthum、柔毛淫羊藿等具有多个类型的非腺毛，本文将柔毛淫羊藿的非腺毛细分为5个类型。

柔毛淫羊藿最常见的是a类长直毛，而且在具有b～e类型毛居群的非腺毛中或多或少能看见a类长直毛，所以柔毛淫羊藿中a类长直毛是最典型也是最原始的非腺毛，b等类型为次生类型。短伏毛成都居群和e类长伏毛陕西南郑和湖北十堰属于聚类分析的第Ⅱ类。笔者通过ISSR分子标记与不同居群的非腺毛进行了比较，伏毛和直毛在遗传多样性上分为2类。

在仅具有a类长直毛9个居群其中8个居群属于ISSR基于遗传一致度聚类分析的第Ⅰ类，CQTN居群属于遗传一致度聚类分析的第Ⅲ类，b类长卷曲毛SCLC居群和c类伏卷曲毛SCHY居群也属于第Ⅰ类，b类长卷曲毛SCYA居群属于第Ⅱ类，b类长卷曲毛应该是在a类长直毛基础上的变异类型，即顶细胞发生了卷曲，c类伏卷曲毛又在b类长卷曲毛基础发生了顶细胞与基细胞产生夹角。洪雅c类伏卷曲毛，虽然也属伏毛大类，可能因为与其他直毛居群地理间隔较近，遗传多样性仍然归为Ⅰ类，另外3个居群2种伏毛，d类拟短伏毛和e类长伏毛归为Ⅱ类。

44遗传多样性和遗传结构遗传多样性一般是指种内的遗传差异水平，反映一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的潜力。本研究应用筛选到的 8条ISSR 引物在15个不同居群柔毛淫羊藿中检测到了较丰富的遗传多样性，多态位点百分率（PPB）达到9574%，Shannon（I）多样性指数0483 4±0190 6。如此丰富的遗传多样性，说明柔毛淫羊藿具有较强的区域适应能力和进化潜力。

遗传结构就是遗传变异或者说基因和基因型在时间和空间上的分布式样，是一个物种最基本的特征之一，它受突变、基因流、选择和遗传漂变的共同作用，同时还和物种的进化历史和生物学特性有关[19]。Hamrick等[20]研究结果表明，植物类群的分类地位、习性、交配系统、种子扩散机制、分布地区和演替阶段对居群遗传分化程度都有显著的影响。而其中交配系统（远交或近交所占比例）、分布范围和生活型对居群遗传结构的影响最大[21]。近交，不管是自交还是血缘相近个体间的交配，均会增加结合配子之间的一致性，降低重组从而导致家系内的个体更加一致，家系间出现遗传分化。本研究显示柔毛淫羊藿基因流Nm 0354 4，说明居群间基因交流很少。基因分化系数Gst 0585 2，各居群间存在较大的遗传分化，是Hamrick等[20]得出的平均值0228 0的2倍多，其原因可能有以下几点：柔毛淫羊藿自交率高。Suzuki[22]对日本淫羊藿属植物的研究表明：淫羊藿为可兼性自花授粉的虫媒花，共有2种类型的传粉者，一类是一些专门采集花粉的小蜂；另一类主要是吸取花蜜为食的中等大小或体型更大些的蜂类，前者光顾所有的花朵，而后者是选择性的光顾。采集花粉型的蜜峰对淫羊藿属种内的基因流起了重要的作用，而吸取花蜜型的蜂类通过它们有选择的授粉则加强了淫羊藿属各种间的分化。这些传粉者经常拜访同一花序或同一植株不同花序的多个花朵然后才转移到另一植株上，通常是同株授粉，即自交率高，自交會导致居群间的遗传分化；柔毛淫羊藿种子散布范围小。淫羊藿以种子繁殖为主，结实率中等，种子散布主要靠自然散落、蚂蚁搬运，偶然情况下的水流搬运，淫羊藿属植物的种子具有白色附属物，被认为这更可能是蚁播植物的特点[23]。在植物中，基因流是通过花粉和种子扩散实现的，柔毛淫羊藿从花粉和种子散布上都范围小，因此导致居群之间的遗传分化显著；本文的研究对象基本覆盖了柔毛淫羊藿分布的主要区域，除了SCQCS，SCCZ和SCHY，SCYA居群间直线地理距离较近外，其他个居群间都相距较远，皆超过50 km，地理间隔较远。综上所述各种因素阻碍了基因交流，最终导致了居群间较高的遗传分化。

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[责任编辑吕冬梅]endprint