3个居群野生草地早熟禾耐盐性比较研究

张 燕， 朱慧森， 白永超， 黄志超， 胡 婧， 董宽虎， 李存福

(1. 山西省农业科学院畜牧兽医研究所， 山西 太原 030032； 2. 山西农业大学动物科技学院， 山西 太谷 030801；3. 全国畜牧总站， 北京 100125)

土壤盐渍化问题已成为环境的主要问题之一[1-2]，据统计，我国盐渍土面积约为3 460万hm2 [3]，其中山西省盐碱地约26.18万hm2，占平川总土地面积的9.9%[4]。山西地处内陆地区，由于降水量稀少，淋溶作用弱，地表和地下水蒸发强烈，再加上不合理的灌溉，使土壤的盐渍化和次生盐渍化问题越来越严重。随着城市绿地面积需求的日益扩大，大面积的盐渍土壤用于建植草坪，常常造成出苗困难、生长缓慢、整齐度差或者返青延迟、秋季早衰、秃斑甚至死亡的现象[5]。

草地早熟禾是目前世界上应用最为广泛的冷季型草坪建植材料。草地早熟禾建植区域常出现因土壤自身盐渍化、灌溉水的含盐量高或排水设施不健全或不畅而造成的植株稀疏、斑秃等现象。草坪草的抗盐性直接表征其对盐胁迫的反应及适应性。目前，针对草地早熟禾草坪盐胁迫的研究已有报道：Dai等研究了盐胁迫对草地早熟禾萌发及生长的影响[6-9]；Xu等研究了盐胁迫对草地早熟禾生理生化特性的影响[10-12]；Bushman等研究了盐胁迫下草地早熟禾转录组和基因表达的差异[13-15]；另外还有学者研究了一些外源物质对盐胁迫下草地早熟禾的缓解效应[16-21]。但以上工作主要集中在引进草地早熟禾品种，相关具有优良耐盐基因的野生草地早熟禾种质的耐盐性研究较少。

山西省地域广阔，野生草地早熟禾资源极其丰富[22]，本课题组近几年收集了山西境内49个居群的野生草地早熟禾，并对其进行了种质资源评价、农艺性状、遗传多样性以及耐旱、耐热等方面的研究[23-28]，本文选取了坪用性状和抗旱性表现较好的3个居群进行NaCl溶液胁迫试验，研究草地早熟禾对NaCl胁迫的耐受阈值及生理响应机制，为今后引种驯化耐盐品种及盐碱地区草坪草的建植管理提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验在山西农业大学动物科技试验站日光能温室进行(37°25′ N，112°23′ E，海拔799 m)，属晋中盆地，光能资源丰富，日光能温室平均温度15～30℃，相对湿度60%～80%。

1.2 试验材料

试验材料为山西3个不同居群野生草地早熟禾，于2009年和2010年分别采集于山西浑源县悬空寺路边(39°36′ N,113°42′ E，海拔1 184 m)，以HY表示；山西应县西米庄村河边(39°36′ N,113°07′ E，海拔993 m)，以YX表示、山西沁水县南河村路边(35°32′ N,111°59′ E，海拔1 311 m)，以QS表示。

1.3 试验设计

2015年9月10日将3个居群野生草地早熟禾种子在日光能温室中育苗，育苗盘72孔，育苗基质为过筛无杂质细土壤，种子均匀播种后在表层撒无杂质细沙0.5 cm。育苗前期保持土壤充分湿润，昼夜日均温控制在(25±2℃)/(15±2℃)。

播种48 d后，将植株移栽到装有同等重量基质的无孔塑料盆(直径25 cm、高20 cm)中，基质为沙子(过筛后水洗晒干)与珍珠岩(体积比3:1，充分混匀)的混合物。每盆中预先插入直径1 cm、长25 cm的PVC管，浇水、营养液和NaCl溶液时直接顺着管口流入盆底，每盆均匀移栽65株。待植株完全成活后，每盆间至50株，并且每7 d用Hoagland营养液[29]浇灌。移栽45 d后，将其修剪至相同高度，用分析纯NaCl加蒸馏水配置浓度0(CK)、50 mmol·L-1、100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1、250 mmol·L-1、300 mmol·L-1的NaCl溶液，按预先实验盆土最大持水量的70%进行浇灌，各处理重复3次。胁迫期间每天进行称重，用蒸馏水补充损失水分，以保证每盆中盐浓度恒定。

1.4 样品的采集

胁迫26 d后用CI-340光合测定仪测定草地早熟禾幼苗从顶部向下展开的第2～3片叶的光合参数。同时采集新鲜叶片测定相对含水量和质膜相对透性，其它材料液氮冷冻，-70℃冰箱中贮存，待测。

1.5 测定指标及方法

采用称重法[30]测定叶片相对含水量(relative water content，RWC)，氮蓝四唑(NBT)光还原法[30]测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，酸性茚三酮法[30]测定脯氨酸(Pro)含量，可溶性糖(soluble sugar，SS)含量测定采用蒽酮比色法[30]，可溶性蛋白(soluble protein，SP)含量测定采用考马斯亮蓝法[30]，硫代巴比妥酸法[30]测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，电导法[31]测定质膜相对透性。光合参数的测定包括净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，蒸腾速率(Tr)，胞间CO2浓度(Ci)等，每个处理重复3次。

1.6 耐盐性综合评价方法

采用模糊数学隶属函数法对不同居群野生草地早熟禾进行耐盐性综合评价，利用以下公式进行标准化处理：

(1)与耐盐性正相关的指标用隶属函数

X(U)= (X - Xmin) /(Xmax- Xmin)

(2)与耐盐性负相关的指标用反隶属函数

X(U)= 1 - (X - Xmin) /(Xmax- Xmin)

式中，X为某一耐盐指标的实际测定值，Xmax为该指标的最大值，Xmin为该指标的最小值。

先求出各个居群的不同耐盐指标在不同盐浓度下的隶属值，然后把每一指标在不同浓度下的隶属值累加求平均值，再将每个居群各耐盐指标的隶属值累加，求其平均值，平均值越大，说明耐盐性越强[32]。

1.7 数据分析

采用Excel 2003处理原始数据，计算各指标的平均值、标准差和变异系数，用SAS 9.2软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对野生草地早熟禾叶片相对含水量的影响

从图1可以看出，随着NaCl浓度的增加，3个居群草地早熟禾叶片相对含水量均呈现下降趋势。当盐浓度为50 mmol·L-1时，3个居群叶片相对含水量与对照相比均无显著性差异，说明此浓度的盐胁迫对野生草地早熟禾影响较小；当盐浓度为100 mmol·L-1及以上时，3个居群叶片相对含水量均显著低于对照(P<0.05)，且随着盐浓度的增加，居群间差异增大，当NaCl浓度为300 mmol·L-1时，3个居群之间差异达显著水平(P<0.05)，与对照相比，QS居群、YX居群和HY居群叶片RWC分别降低了38.9%，31.3%和18.8%。

2.2 NaCl胁迫对野生草地早熟禾质膜相对透性的影响

由图2可以看出，随着NaCl浓度的增加，3个居群草地早熟禾叶片质膜相对透性均呈增加趋势。在盐浓度为50 mmol·L-1和100 mmol·L-1时，3个居群叶片质膜相对透性与对照相比均无显著性差异；但当盐浓度为150 mmol·L-1及以上时，3个居群叶片质膜相对透性均显著高于对照(P<0.05)，且随着盐浓度的增加，居群间差异增大，均表现为QS居群>YX居群>HY居群，当NaCl浓度为300 mmol·L-1时，QS居群、YX居群和HY居群的质膜相对透性分别为对照的7.4倍,7.1倍和4.2倍。

图1 NaCl胁迫下3个居群草地早熟禾叶片相对含水量Fig. 1 RWC of leaves in three wild Poa pratensises accessories under NaCl stress注：不同大写字母表示同一盐浓度不同居群间差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示同一居群不同盐浓度下差异显著(P<0.05)。下同Note：Different uppercases indicate significant difference between different accessories in the same concentration of NaCl at the level of 0.05；different lowercases indicate significant difference of the same accessory between different concentrations of NaCl at the level of 0.05. The same as below

图2 NaCl胁迫下3个居群草地早熟禾叶片质膜相对透性Fig.2 Relative permeability of plasma membrane of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.3 NaCl胁迫对野生草地早熟禾SOD活性的影响

由图3知，随NaCl胁迫浓度的升高，YX、QS两个居群野生草地早熟禾的SOD活性均呈先升高后降低的趋势，分别于250 mmol·L-1和200 mmol·L-1时活性最大，而HY居群则呈逐渐升高的趋势。在胁迫浓度为50 mmol·L-1时，3个居群野生草地早熟禾SOD活性均与对照无显著差异；当胁迫浓度为150 mmol·L-1及以上时，3个居群的SOD活性均显著高于对照(P<0.05)；在NaCl胁迫浓度为0和300 mmol·L-1时，3个居群间SOD活性差异均显著(P<0.05)。

图3 NaCl胁迫下3个居群草地早熟禾SOD活性Fig.3 SOD activities of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.4 NaCl胁迫对野生草地早熟禾MDA含量的影响

从图4可以看出，随着NaCl胁迫浓度的升高，3个居群野生草地早熟禾MDA含量均呈升高趋势，3个居群中HY居群MDA含量上升速度较为平稳。当盐浓度为50 mmol·L-1时，3个居群的MDA含量与对照相比均无显著差异；当盐浓度为100 mmol·L-1及以上时，YX和QS居群MDA含量均显著高于对照(P<0.05)，其中QS居群在处理间差异均达显著水平(P<0.05)，而HY居群在盐浓度为200 mmol·L-1及以上时，MDA含量显著高于对照且处理间差异显著(P<0.05)；当盐浓度为300 mmol·L-1时，QS居群、YX居群、HY居群的MDA含量分别是对照的4.0倍、3.4倍和2.2倍。盐浓度为0～50 mmol·L-1时，3个居群间MDA含量差异不显著；当盐浓度为100 mmol·L-1时，QS居群MDA含量显著高于YX居群和HY居群(P<0.05)，后二者之间差异不显著；其它浓度处理时，3个居群间MDA含量差异显著(P<0.05)，且均表现为QS居群>YX居群>HY居群。

图4 NaCl胁迫下3个居群草地早熟禾MDA含量Fig. 4 MDA contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.5 NaCl胁迫对野生草地早熟禾Pro含量的影响

从图5可以看出，随着NaCl胁迫浓度的升高，3个居群野生草地早熟禾的Pro含量均呈上升趋势。在盐浓度为50 mmol·L-1时，3个居群Pro含量与对照相比无显著差异；当胁迫浓度为100 mmol·L-1及以上时，各居群Pro含量均显著高于对照(P<0.05)；当盐浓度为300 mmol·L-1时，HY居群、YX居群和QS居群的Pro含量分别比对照增加了122.5%、118.8%和113.5%。在NaCl浓度为0～150 mmol·L-1时，HY居群Pro含量显著高于YX居群和QS居群(P<0.05)，后二者间差异不显著；在NaCl浓度为200～300 mmol·L-1时，3个居群的Pro含量表现为HY居群>YX居群>QS居群，居群间差异均显著(P<0.05)。

图5 NaCl胁迫下3个居群草地早熟禾Pro含量Fig.5 Proline contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.6 NaCl胁迫对野生草地早熟禾SS含量的影响

从图6可以看出，随NaCl胁迫浓度的升高，YX居群和QS居群野生草地早熟禾SS含量呈现先增加后降低的趋势，均于NaCl浓度为250 mmol·L-1时达到最高，而HY居群则呈现持续升高趋势；各居群受盐胁迫后的SS含量均显著高于对照(P<0.05)；当盐浓度为0～250 mmol·L-1时，3个居群间SS含量差异均不显著，但当盐浓度为300 mmol·L-1时，HY居群SS含量显著高于YX和QS居群(P<0.05)，但后二者间差异不显著。

图6 NaCl胁迫下3个居群野生草地早熟禾SS含量Fig.6 Soluble sugar contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.7 NaCl胁迫对野生草地早熟禾SP含量的影响

从图7可以看出，随NaCl胁迫浓度的升高，3个居群野生草地早熟禾的SP含量均呈降低趋势。当盐浓度为100 mmol·L-1或更高时，3个居群SP含量均显著低于对照(P<0.05)；当盐浓度为300 mmol·L-1时，QS居群、YX居群、HY居群的SP含量分别较对照下降55.3%、46.27%和35.65%。当盐浓度为0～100 mmol·L-1时，3个居群间SP含量均无显著差异；当盐浓度为200 ～300 mmol·L-1时，3个居群间的SP含量差异均显著(P<0.05)。

图7 NaCl胁迫下3个居群野生草地早熟禾SP含量Fig.7 Soluble protein contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.8 NaCl胁迫对野生草地早熟禾光合参数的影响

由图8可知，随着NaCl浓度的升高，3个野生草地早熟禾居群的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)均呈下降趋势，胞间CO2浓度(Ci)均呈现先降低后升高的趋势，NaCl浓度为150 mmol·L-1时最低。当盐浓度为300 mmol·L-1时，QS、YX、HY居群的Pn值较对照分别下降52.62%,47.02%和40.0%，Gs值较对照分别下降44.5%,40.9%和29.9%；Tr较对照分别下降46.77%,43.70%,39.73%。

图8 NaCl胁迫下3个居群草地早熟禾净光合速率Fig.8 Net photosynthesis rate of three wild Poa pratensis under NaCl stress

图9 NaCl胁迫下3个居群野生草地早熟禾蒸腾速率Fig.9 Transpiration rate of three wild Poa pratensis under NaCl stress

图10 NaCl胁迫下3个居群野生草地早熟禾气孔导度Fig.10 Stomatal conductance of three wild Poa pratensis under NaCl stress

图11 NaCl胁迫下3个居群野生草地早熟禾胞间CO2浓度Fig.11 Intercelluar CO2 concentrations of three wild Poa pratensis under NaCl stress

2.9 不同居群野生草地早熟禾耐盐性综合评价

采用模糊数学隶属函数法对3个居群7个耐盐相关指标的隶属度值进行计算，以各指标隶属度平均值作为耐盐性的综合评价指标，数值越大表明其耐盐性越强。结果(表1)表明，3个居群的耐盐性强弱排序为：HY居群>YX居群>QS居群。

3 讨论

草坪草在盐胁迫时生长受到抑制，叶色发黄、萎蔫、甚至死亡，极大地影响其景观效果。同时，其体内的一些生理指标也会发生改变，如膜透性增加、光合能力下降等。

表1 3个居群野生草地早熟禾耐盐隶属函数值Table 1 Subordinate function value of salt tolerance for three wild Poa pratensis accessories

叶片相对含水量是反映植物组织中吸水量与失水量的动态指标，是植物细胞正常生理活动的基础，逆境中植物叶片相对含水量的大小，可以反映植物的抗逆性[33]。相关研究[34-35]表明，在盐胁迫处理后，叶片相对含水量下降缓慢且下降幅度小的植物耐盐性强。本试验中，300 mmol·L-1的NaCl处理下，各居群草地早熟禾叶片相对含水量较对照的下降幅度表现为：QS居群>YX居群>HY居群，说明从相对含水量的变化角度分析其耐盐性大小为HY居群>YX居群>QS居群。

盐胁迫会造成植物膜透性增强和膜脂过氧化，导致细胞膜系统损伤，膜的完整性被破坏，MDA是膜脂过氧化的最终产物，质膜透性与MDA含量反映细胞膜受损伤的程度[36-38]。本试验中，各材料随着盐浓度的升高，质膜相对透性和MDA含量均呈现上升趋势，50 mmol·L-1NaCl胁迫下，与对照差异不显著，说明此浓度对野生草地早熟禾居群的质膜系统影响不明显；当NaCl浓度为200～300 mmol·L-1时，所有材料的质膜相对透性和MDA含量均迅速升高，且显著高于对照。由上，受NaCl胁迫的植株质膜透性显著增大和显著高于对照时的初始浓度在不同居群表现出差异，其中HY居群的质膜相对透性和MDA含量上升较为平缓，说明HY居群对NaCl胁迫的抵御能力较强。

相关研究表明[39-40]，在一定盐浓度范围内，随着盐浓度的增加,植物体内保护酶活性呈现升高趋势，但当盐浓度超过一定范围时，植物体内积累的活性氧超出保护酶清除范围，植物不能正常生长甚至死亡。本试验中，0～300 mmol·L-1NaCl胁迫范围内，QS和YX 2个居群的SOD活性先升高后降低，HY居群的SOD活性则始终增强，初步推断HY居群的耐盐阈值较高。试验充分说明在一定盐胁迫范围内，草坪草可对胁迫产生一定的适应性反应，表现为酶活性增强，但当胁迫强度过大，超过植物的耐受阈值，植物就会崩解甚至死亡。这与梁慧敏[41]对草地早熟禾和黑麦草研究得出的SOD活性在中等盐浓度时达到最大值，但随着盐浓度的增大酶活性又下降的结果一致。

在逆境条件下，植物会迅速积累一些无机离子或合成一些有机物进行渗透调节，增强植物的抵抗能力。其中，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物组织中重要的渗透调节物质，能提高植物的渗透调节能力，降低因渗透失水引起的质膜、蛋白质以及一些功能的伤害。相关研究表明[12,41-42]，判断植株耐盐能力的强弱，应以脯氨酸在胁迫前后的变化幅度来鉴定[43]。从本试验结果看出，在胁迫范围内，脯氨酸含量随盐浓度的增加呈升高趋势，不同居群脯氨酸的增加幅度不同，胁迫前后HY居群的变化幅度最大，QS居群最小，表明HY居群对NaCl的耐受能力较强。有研究指出[44]，植物组织中积累的可溶性糖含量与植物的抗逆性呈正相关。本试验中，YX、QS 2个居群的草坪草可溶性糖含量均呈现先升高后降低的趋势，盐浓度升高到250 mmol·L-1时的可溶性糖含量均最高，300 mmol·L-1NaCl处理下，组织内含糖量降低，分析可能的原因是高浓度盐胁迫影响植物的正常生长代谢，植物自身合成糖量减少，致使组织内可溶性糖含量降低；HY居群可溶性糖随NaCl浓度升高而升高，可能是HY居群在胁迫范围内组织中糖类的合成正常，且糖的利用量降低的原因所致。李艳波[45]、梁敏[46]等研究发现，盐胁迫会抑制可溶性蛋白质的合成。本试验中，3个居群的可溶性蛋白均随盐浓度的升高而降低，降幅由大到小依次为QS居群、YX居群、HY居群，降幅较大的居群耐盐性弱。

盐胁迫会影响植物的光合作用，导致光合参数发生变化。有关研究表明[47-50]，高浓度的NaCl胁迫使草坪草的Pn、Gs、Tr显著降低，不同的草坪品种下降幅度有差异。本试验得出，3个不同居群野生草地早熟禾在盐胁迫处理后，其叶片的Pn、Gs、Tr均随胁迫浓度的升高呈降低趋势，且下降幅度表现一致，均为QS居群>YX居群>HY居群。有研究指出[51]，耐盐性强的品种光合作用受抑制的程度比耐盐性弱的品种小，它具有更好的保护光合结构的能力。HY居群在NaCl胁迫下，能保持相对较高的光合速率、气孔导度和蒸腾速率，表明HY居群比其它2个居群可能具有更好的自我保护能力，相对受盐害的影响较小。本试验结果与孙国荣[52]关于星星草的研究结果一致。

Dunn和Neales[53]的相关研究表明，如果胁迫处理致使植物叶片Gs降低同时Ci浓度也降低，这时气孔限制是影响植物光合作用的主要因素。如果Gs降低，但植物组织内的Ci浓度升高或不变，这时影响植物光合作用的主要因素是非气孔限制，即可能受酶活性影响[54]。本试验中，NaCl胁迫浓度0～150 mmol·L-1时，叶片气孔收缩，Gs降低，但叶肉细胞仍进行光合作用，光合作用的光反应阶段消耗了组织内的二氧化碳，导致Ci降低，说明此时气孔因素是影响光合作用的主要因素；NaCl胁迫浓度200～300 mmol·L-1时，植物的光合组织被破坏，光合作用减弱，二氧化碳利用减少，导致Ci升高，3个居群的Ci均较对照高，而Pn和Gs低于对照，说明此时主要是非气孔因素影响光合作用。本试验结果与Khavarinejad和Chaparzadeh[55]的结果一致。

4 结论

通过对NaCl胁迫下3个居群的相对含水量、质膜透性、MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、SOD以及Pn、Gs、Tr、Ci等参数的分析，可以较全面地评析3个野生草地早熟禾居群的耐盐性。采用隶属函数法综合分析得出3个居群耐盐性依次为HY居群>YX居群>QS居群。已有的研究[56-57]表明，草地早熟禾栽培种的耐盐阈值为150～200 mmol·L-1，对比发现，山西3个居群野生草地早熟禾的耐盐性均高于栽培品种。因此在盐渍地建植草坪时，经引种驯化后坪观质量好的野生草地早熟禾将是最佳的草种选择之一。