青蒿琥酯对糖尿病肾病大鼠Toll样受体及白细胞介素-8表达的影响

杨志刚，张南楠

1.福建中医药大学附属人民医院内分泌科，福州350004；2.福建医科大学附属第三医院肿瘤内科，福州350001

青蒿琥酯对糖尿病肾病大鼠Toll样受体及白细胞介素-8表达的影响

杨志刚1，张南楠2

1.福建中医药大学附属人民医院内分泌科，福州350004；2.福建医科大学附属第三医院肿瘤内科，福州350001

目的通过检测糖尿病大鼠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的表达，探讨青蒿琥酯保护肾脏的机制。方法 将80只雄性Wistar大鼠随机分为4组，每组20只。成功建立大鼠糖尿病肾病模型后，正常对照组与模型对照组均予1m L/(kg·d)生理盐水灌胃；青蒿琥酯小剂量组予10mg/(kg·d)青蒿琥酯灌胃；青蒿琥酯大剂量组予30 mg/(kg·d)青蒿琥酯灌胃。给药8周后，检测大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、TLR4蛋白表达及IL-8表达。结果青蒿琥酯大剂量组、青蒿琥酯小剂量组的体重高于模型对照组，肾脏肥大指数低于模型对照组，肾组织TLR4蛋白表达、血清及肾组织IL-8水平均低于模型对照组（均<0.05）。结论青蒿琥酯能够抑制肾组织TLR4蛋白表达，减少IL-8释放，改善糖尿病肾病模型大鼠的炎症反应。

青蒿琥酯；糖尿病肾病；类Toll受体4；白细胞介素-8

近年来，糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）已成为糖尿病最常见的并发症之一。DN主要损伤微小血管，发病机制复杂多样[1]。病理机制主要为血流动力学障碍、紊乱的糖代谢、氧化应激反应、胰岛素抵抗及免疫炎症反应[2]，其中免疫炎症反应能够导致终末期肾病[3]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)与炎症因子白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是介导免疫炎症反应的主要因素，随着DN进展TLR4及IL-8逐步升高[4]。青蒿琥酯是青蒿素合成的衍生物，具有延缓细胞增生和调节免疫反应等特点[5]。前期研究结果显示青蒿琥酯能够抑制肾脏的炎症反应，促进肾脏组织修复，降低肾脏间质中TLR4及IL-8的表达水平，减少炎症因子释放，然而关于青蒿琥酯干预DN肾组织中TLR4与IL-8表达的研究尚少[6]。本研究通过青蒿琥酯治疗DN模型大鼠，检测肾脏组织中TLR4与IL-8的表达变化，探讨青蒿琥酯保护肾脏的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级雄性Wistar大鼠80只分笼饲养，体重（230±30）g，由浙江司康科技生物公司提供，许可证号SCXK(2015-0001)。动物实验室温度在20℃～25℃，相对湿度50%～60%，根据动物伦理学标准对实验大鼠进行处置。

1.2 实验材料 链脲佐菌素(STZ)购于上海博得生物技术公司；青蒿琥酯购于深圳中联制药股份有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG购于南京乔伊生物科技有限公司；大鼠血肌酐检测试剂盒及尿素氮检测试剂盒均购于上海科瑞达生物科技有限公司；大鼠IL-8酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购于南京凯瑞生物科技有限公司；大鼠TLR4多克隆抗体购自上海利丰生物科技有限公司；硝酸纤维素膜购自上海圣武达生物科技有限公司；ECL发光试剂购于北京顺莱生物科技有限公司。

1.3 方法 将80只大鼠适应性饲养1周，每天测量大鼠体重，随机分为正常对照组、模型对照组、青蒿琥酯大剂量组和青蒿琥酯小剂量组，每组20只。其中正常对照组予普通饲料喂养，模型对照组、青蒿琥酯大剂量组和青蒿琥酯小剂量组等造模大鼠喂养高糖高脂饲料，根据实验文献[5]调配饲料配方。造模大鼠喂养至第4周末，禁食12 h后腹腔注射STZ 30mg/kg，建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立的指标为连续3次随机血糖>16.7 mmol/L，造模成功后继续高糖高脂饲料喂养大鼠4周后开始给药。正常对照组与模型对照组予1m L/(kg·d)生理盐水灌胃；青蒿琥酯大剂量组与青蒿琥酯小剂量组分别给予30mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d)青蒿琥酯灌胃。各组连续给药8周后检测大鼠24h尿蛋白定量、血肌酐(serum creatinine,Cr)、血尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、TLR4蛋白表达及IL-8表达。

1.4 评价指标

1.4.1 标本采集 采用10%水合氯醛0.3m L/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后从大鼠的心脏采血4～5mL，室温下将血放置1 h，3 000 r/min离心10m in，收集上层血清并放入-80℃冰箱冻存。处死大鼠后取出大鼠左肾，用滤纸将大鼠肾脏血迹吸干，放置在电子天平测量大鼠肾脏质量（g），计算大鼠肾脏肥大指数（kidney index,KI）=肾湿质量（mg）/体重（g）。

1.4.2 检测指标 用代谢笼采集大鼠24h尿量，将标本送至福建中医药大学附属人民医院中心实验室，检测每只大鼠的24h尿蛋白。在各组大鼠禁食不禁水12h后采集大鼠静脉血，检测大鼠的体重与空腹血糖（fastingblood-glucose，FPG）、Cr及BUN。采用Western blot法检测TLR4蛋白的表达，并用图像分析软件测量行TLR4蛋白灰度值，TLR4蛋白表达值=TLR4灰度值/内参-actin灰度值。IL-8采用ELISA法进行检测，严格按照购买的试剂盒说明进行操作，将大鼠标本设定2个复孔，在450nm波长处检测吸光度（optical density,OD）值，按照标准曲线和OD值测量每个标本的浓度。

1.5 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组组间比较采用LSD-，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠FPG、体重及KI比较 青蒿琥酯大剂量组和青蒿琥酯小剂量组的体重高于模型对照组，差异有统计学意义（<0.05）。青蒿琥酯大剂量组和青蒿琥酯小剂量组的KI低于模型对照组，差异有统计学意义（<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠24 h尿蛋白、Cr及BUN比较 模型对照组、青蒿琥酯大剂量组及青蒿琥酯小剂量组24h尿蛋白、Cr和BUN水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（<0.05）。青蒿琥酯大剂量组及青蒿琥酯小剂量组的24h尿蛋白、Cr和BUN水平均低于模型对照组，差异有统计学意义（<0.05）。青蒿琥酯小剂量组24h尿蛋白、Cr和BUN水平均高于青蒿琥酯大剂量组，差异有统计学意义（<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠TLR4蛋白表达及IL-8水平比较 模型对照组、青蒿琥酯大剂量组和青蒿琥酯小剂量组的肾组织TLR4蛋白表达、血清及肾组织IL-8水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（<0.05）。青蒿琥酯大剂量组和青蒿琥酯小剂量组的肾组织TLR4蛋白表达、血清及肾组织IL-8水平均低于模型对照组，差异有统计学意义（<0.05）。青蒿琥酯小剂量组肾组织TLR4蛋白表达、血清及肾组织IL-8水平均高于青蒿琥酯大剂量组，差异有统计学意义（<0.05）。见表3、图1。

表1 各组大鼠FPG、体重及KI比较

表2 各组大鼠24 h尿蛋白、Cr及BUN比较

表3 各组大鼠TLR4蛋白表达及IL-8水平比较

图1 各组大鼠肾组织TLR4蛋白表达

3 讨论

胰岛 细胞功能低下和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病因。老年人胰岛细胞本身老化，靶细胞膜上胰岛素受体数目减少，在胰岛素抵抗的基础上，胰岛细胞长期过度负荷，分泌功能失去代偿，致使血糖升高和糖代谢异常加重。因此老年人胰岛素分泌显著降低，血糖随年龄的增长而升高。由于老年人糖尿病起病隐匿，更易诱发DN，临床上尤为重视[7-8]。

近年来关于DN发病机制的研究已较为成熟。研究发现糖尿病能够干预机体内环境的平衡，从而释放炎症介质，导致机体的肾脏细胞出现损伤，严重者出现肾小球硬化及肾间质纤维化等病理改变[9]。前期研究显示DN患者存在炎症细胞浸润以及细胞因子和炎症介质水平升高，提示慢性持续性炎症反应是DN持续发展的关键因素[3]。本研究从炎症反应角度探讨DN发展恶化的原因，采用腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，模型建立后造模大鼠体重明显减轻，考虑由于大鼠胰岛素分泌不足，机体不能充分利用葡萄糖，继而分解脂肪和蛋白质补充能量引起体重下降，而经过用药处理后的大鼠体重上升明显，可能是大鼠糖尿病症状有所缓解所致。

TLR4是免疫炎症反应的重要参与因素[10]，其信号通路是建立在髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88,MyD88)依赖的或非MyD88依赖的信号通路上，作用于机体产生生物活性[11]，激活通路之后，开始合成或释放各种炎症介质，包括IL-8和肿瘤坏死因子-等，产生相关炎症反应[12]。机体处于DN状态时，能够损伤细胞因子，通过干预TLR4介导生成大量炎症因子，产生免疫反应造成肾脏损伤[13]。另外研究发现当机体处于高糖水平时，TLR4-MyD88的信号通路被激活，生成了大量的下游炎性因子，说明高糖水平是引发TLR4活化的诱因之一，与M yD88依赖的信号途径激活相关[14]。本实验发现青蒿琥酯大剂量组与青蒿琥酯小剂量组的肾组织TLR4蛋白表达、血清及肾组织IL-8水平均低于模型对照组（<0.05），与上述研究结果一致，从而证明了糖尿病状态下，通过TLR4信号通路进一步产生免疫炎症，最终损伤肾脏。因此抑制TLR4介导的免疫炎症反应是改善DN肾脏损伤的关键因素[15]。

研究发现青蒿琥酯作为一类倍半萜类化合物，有免疫炎症抑制作用[16]。本次研究发现，青蒿琥酯大剂量组与小剂量组的TLR4蛋白表达及IL-8水平均低于模型对照组，且青蒿琥酯大剂量组的治疗效果优于小剂量组，说明青蒿琥酯抑制TLR4表达、减少IL-8，降低肾脏炎症反应的风险，避免肾脏病理损伤。另外，青蒿琥酯大剂量组与青蒿琥酯小剂量组的24 h尿蛋白、Cr和BUN水平均低于模型对照组（ffffc7<0.05），说明DN的持续性炎症反应与TLR4的表达异常有相关性。同时肾组织IL-8高表达与24 h尿蛋白量、血Cr及BUN高表达密切相关，由此推断IL-8可以作为判断肾脏损伤程度的一个指标。此外本研究发现模型对照组、青蒿琥酯大剂量组及青蒿琥酯小剂量组的组间FPG无明显差异，表明青蒿琥酯修复肾脏病理损伤的机制与血糖无相关性。

综上所述，青蒿琥酯能够控制肾组织TLR4蛋白表达，减少IL-8释放，改善DN的炎症反应。炎症因子TLR4和IL-8可能协同参与了DN的发生发展。青蒿琥酯可以有效减少炎症反应，缓解DN导致的肾脏肥大，为临床治疗DN提供了新的理论依据。

[1]Navarro-Gonzalez JF,Mora-Fernandez C.The roleof inflammatory cytokines in diabetic nephropathy[J].JAm Soc Nephrol,2008, 19(3):433-442.

[2]Kelly KJ,Dom inguez JH.Rapid progressionofdiabeticnephropathy is linked to inflammation and episodesof acute renal failure[J]. Am JNephrol,2010,32(5):469-475.

[3]Wada J,Makino H.Inflammationand thepathogenesisofdiabetic nephropathy[J].ClinSci(Lond),2013,124(3):139-152.

[4]Mezzano S,Aros C,Droguett A,.NF-kappaB activation and overexpression of regulated genes in human diabetic nephropathy[J].NephrolDialTransplant,2004,19(10):2505-2512.

[5]蒋姗姗，龙艳，苏珂，等．青蒿琥酯对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡及TNF-、IL-8表达的影响[J]．天津医药，2015，43（1）：20-24．

[6]Navarro-González JF,Mora-Fernández C,Muros De FuentesM, .Inflammatorymoleculesand pathways in thepathogenesis of diabetic nephropathy[J].Nat Rev Nephrol,2011,7(6): 327-340.

[7]孙世澜，曾红兵．老年人糖尿病肾病的治疗[J]．中华老年医学杂志，2006，25（1）：18-19．

[8]刘志红，李瑛．老年人糖尿病肾病的特点与防治[J]．中华老年医学杂志，2003，22（4）：199-200．

[9]Dasu MR,DevarajS,Park S,.Increased Toll-Like receptor (TLR)activation and TLR ligands in recently diagnosed type 2 diabetic subjects[J].DiabetesCare,2010,33(4):861-868.

[10]BanasMC,BanasB,HudkinsKL,.TLR4 linkspodocytes w ith the innate immune system tomediate glomerular injury[J]. JAm Soc Nephrol,2008,19(4):704-713.

[11]Kaur H,Chien A,Jialal I.Hyperglycem ia induces Toll like receptor4 expression and activity inmousemesangial cells:relevance to diabeticnephropathy[J].Am JPhysiolRenalPhysiol, 2012,303(8):F1145-F1150.

[12]Zhang B,RameshG,Uematsu S,.TLR4 signalingmediates inflammation and tissue injury in nephrotoxicity[J].JAm Soc-Nephrol,2008,19(5):923-932.

[13]Lim BJ,Hong SW,Jeong HJ.Renal tubularexpression of Tolllike receptor4 in cyclosporinenephrotoxicity[J].APM IS,2009, 117(8):583-591.

[14]Cheng A,Dong Y,Zhu F,.AGE-LDL activates Toll like receptor 4 pathway and promotes inflammatory cytokines production in renal tubularepithelialcells[J].Int JBiolSci,2013, 9(1):94-107.

[15]Hanke ML,Angle A,Kielian T.M yD88-dependentsignaling influences fibrosis and alternativemacrophage activation during Staphylococcusaureusbiofilm infection[J].PLoSOne,2012, 7(8):e42476.

[16]Leemans JC,Butter LM,PulskensWP,.The roleof Tolllike receptor2 in inflammationand fibrosisduring progressive renal injury[J].PLoSOne,2009,4(5):e5704.

Effectof Artesunateon the Expression of Toll-like Receptorand IL-8 in Diabetic Nephropathy Rats

Yang Zhigang1*,Zhang Nannan2
1.Departmentof Endocrinology,People'sHospitalA ffiliated to Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,350004; 2.DepartmentofOncology,Third A ffiliated Hospitalof FujianMedicalUniversity,Fuzhou,350001;Fujian Province,P.R.China

Objective To detect the expression of toll-like receptor4(TLR4)and interleukine-8(IL-8)in DN rats so as to explore the protective effectof artesunate on kidney.Methods 80Wistar ratswere random ly divided into 4 groups: normalcontrolgroup,modelcontrolgroup,high-doseartesunategroup and low-doseartesunategroup,20 in each;themodel ofdiabetic nephropathy(DN)wassetup in rats;1m L saline/(kg·d)wasapplied to rats in normalcontrolgroup andmodel controlgroup by gavage;10mg/(kg·d)artesunatewasapplied to ratsin low-doseartesunategroup by gavageand 30mg/(kg ·d)to rats in high-dose artesunate group by gavage;8 weeks later,totalurine protein in 24 hours,blood creatinine,urea nitrogen,and expression levelsof TLR4 and IL-8 in the ratsof the4 groupsweredetected.Results The ratweightin high-dose and low-doseartesunategroupwashigherwhile the kidney hypertrophy indexwas lower than those inmodelcontrolgroup,and theexpressionsof TLR4 and IL-8werealso lower than those inmodelcontrolgroup(<0.05).Conclusions Artesunate can effectively controltheexpression of renalTLR4 proteinexpression,decrease IL-8expression,and improveinflammatory response of DN.

artesunate;diabetic nephropathy;toll-like receptor4;interleukin-8

2017-06-20）

（本文编辑：朱音）

杨志刚，电子信箱:zhigang236@126.com

*Corresponding author:Yang Zhigang,E-mail:zhigang236@126.com