血塞通注射液指纹图谱的聚类分析及溶血性相关分析

程 宾 张红宇 何道慧 王 莉

1.云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650011；2.云南省食品药品监督管理局药品和医疗器械审评中心，云南 昆明 650101

血塞通注射液指纹图谱的聚类分析及溶血性相关分析

程 宾1张红宇1何道慧2王 莉1

1.云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650011；2.云南省食品药品监督管理局药品和医疗器械审评中心，云南 昆明 650101

目的：研究血塞通注射液的HPLC指纹图谱，并进行聚类分析，探讨品种的聚类分析与溶血性的相关性。方法：建立血塞通注射液的HPLC指纹图谱，对10批样品相对峰面积进行聚类，并进行溶血率测定。结果：根据聚类分析结果，可将血塞通注射液样品分为3类，与溶血性测定结果相似。结论：血塞通注射液的HPLC指纹图谱聚类分析结果与溶血性结果有一定相关性。

指纹图谱；溶血性；聚类分析

血塞通注射液主要成份为三七总皂苷，具有活血祛瘀、通脉活络的功效，主要用于中风偏瘫、瘀血阻络证，动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、脑栓塞、视网膜中央静脉阻塞见瘀血阻络证者。该品种临床应用广泛，但皂苷是一类表面活性剂，有很强的乳化力，可使红细胞破裂给机体带来严重危害，其溶血引起的不良反应在临床上也时有报道[1-2]，因此笔者以化学指纹图谱技术展现不同厂家血塞通注射液化学成分的差异，以期寻找到影响血塞通注射液溶血性的主要化学成分。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪( Waters 2996二极管阵列检测器，Empower pro色谱工作站，Waters公司)；SUB28恒温水浴(Grant Instrument Ltd. England)；TLM16M型高速冷冻离心机(湘仪离心机厂)；LD4-2离心机(北京医用离心机厂)；UV-2550 PC型紫外分光光度计(岛津仪器)；DHG-9075 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 材料 氯化钠注射液(500 mL/瓶；500mL：4.5g；批号：A100205p2；昆明南疆制药有限公司)，乙腈为色谱纯，水为高纯水。供试品共来源于五个企业，每个企业两批样品。见表1。

表1 血塞通注射液样品来源

1.3 实验动物 普通级日本大耳白兔，1.7～3.0kg/只，日常行为体征无异常，由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK[滇]2005—0008，发证机关：云南省科学技术厅；实验动物使用许可证：SYXK(滇)2005—0005，发证机关：云南省科学技术厅。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长203nm；流速1.5mL/min；柱温为25 ℃；流动相：A相为乙腈，B相为水，线性梯度洗脱，0～20min保持A∶B=20∶80,20～45min线性至A∶B=46∶54,45～55min线性至A∶B=55∶45,55～60min保持A∶B=55∶45。

2.2 供试品溶液的制备 分别精密吸取格批样品，加70%甲醇稀释至含三七总皂苷2.5mg/mL的溶液，摇匀，即得。

2.3 测定方法 各供试品溶液进样10μL,在上述色谱条件下进行分离测定，记录色谱图。以各色谱峰保留时间为分子，参照物保留时间为分母，计算各色谱峰的相对保留时间；以各色谱峰峰面积为分子，以参照物峰面积为分母，计算各色谱峰的相对峰面积值。见表2。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样5次，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于1%，仪器精密度良好。

2.4.2 重现性试验 取同一样品5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于2%，指纹图谱的全貌无明显变化，符合指纹图谱要求。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在0、2、4、8、16、24、48h进样，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于2%，表明样品在48h内是稳定的。

2.5 不同来源血塞通注射液HPLC指纹图谱分析

2.5.1 HPLC指纹图谱的测定 取不同企业血塞通注射液按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下条件测定并记录色谱图，每个企业取两批样品。不同企业的血塞通注射液色谱图中主要有24个色谱峰，其中6个色谱峰分别在不同企业的血塞通注射液中未检测到，其余19个色谱峰在各企业样品中均可检测到。以各样品均含有且峰面积较大的第2号色谱峰(人参皂苷Rg1)为参照峰，计算各样品的相对峰面积见表2。不同血塞通样品的典型色谱图见图1。

表2 不同样品色谱峰的相对峰面积

注：峰1为三七皂苷R1；峰2为人参皂苷Rg1；峰3为人参皂苷Re；峰7为人参皂苷Rb1；峰14为人参皂苷Rd

2.5.2 指纹图谱系统聚类分析 采用SPSS统计软件对上述指纹图谱数据进行系统聚类分析(Ward`s method)，以相对峰面积值为变量，以欧氏距离( Euclidean distance) 对样品聚类，结果见图2，横坐标为样品间的距离系数，纵坐标为样品编号。由图2可以看出：样品间距离设为5时，10个样品聚为3类，第一类包含样品B、F、G、D、I，第二类包含样品E、H、A、J，样品C单独为一类，结果与其溶血性测定结果有一定的相关性。

2.6 溶血性实验 参考《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅧ B中药注射剂安全性检查法应用指导原则[3]和中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则方法[4]，采用紫外分光光度法测定吸光度值。

2.6.1 红细胞混悬液的配制 兔心脏取血4 mL，用玻璃珠去纤维蛋白原使成脱纤血，加氯化钠注射液，摇匀，离心15 min(1000r/min)，弃上清液，沉淀的红细胞用氯化钠注射液同上法洗涤3 次，至上清液不呈红色，取沉淀红细胞1 mL，加氯化钠注射液稀释至50 mL，混匀，即为2 %红细胞混悬液，备用，用时混匀。

2.6.2 供试品溶液配制 取血塞通注射液用氯化钠注射液稀释制成20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL 3个浓度作为供试液。

2.6.3 试验方法 每批次样品每浓度分别取洁净试管6 支，1、2号管为样品管，3、4号管为阴性对照管，5、6号管为阳性对照管，按表3所示，依次加入2 %红细胞混悬液、氯化钠注射液或蒸馏水和相应浓度供试液，混匀，于37 ℃温育，3h后取出，离心5 min(1000r/min)，采用分光光度法测定各管吸光度值。见表3。

表3 溶血试验加样比例

2.6.4 试验结果 以两平行管吸光度平均值带入公式：溶血率(%)=(样品管-阴性管)吸光度值/(阳性管-阴性管)吸光度值×100 %，计算溶血率，重复试验，结果详见表4。

从表4可见，溶血率从高到低的样品顺序为：H>E>A>J>C>G>D>F>B>I。

表4 血塞通注射液溶血性实验结果

2.7 相关性分析 指纹图谱聚类分析和溶血性实验结果可以发现二者之间有一定的相关性。聚类分析结果中相似度较大的样品溶血性也相近，如样品H、E、A、J溶血率均大于5%，其聚类分析结果该四个样品聚为一类；样品C溶血率为4.982%，聚类分析显示提高距离可以与样品H、E、A、J聚为一类；样品G、D、F、B、I溶血率均小于3%，聚类分析将该五个样品聚为一类。从化学组成来看，血塞通注射液由三七总皂苷制成，其主要成份为：人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd,三七皂苷R1等，而溶血性是皂苷的特性之一，致使中药注射剂产生溶血不良反应，从各个供试品的人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd和三七皂苷R1的相对峰面积及溶血性的结果来看，两者之间无明显的相关性；但是通过全谱的聚类分析后，可以明显看出溶血率相似的样品均被聚为同类，结果表明一些含量较低的成分可能也会对其溶血不良反应起到促进作用，但实际工作中较难控制，需要进一步对各个单体成分与溶血率的关系进行研究。

3 讨论

溶血与凝聚是灭菌制剂安全性质量控制指标之一，随着国家对注射剂安全性的重视程度日渐增加，尤其是中药注射剂，溶血与凝聚已被列为中药注射液安全性必检项目之一，常规的溶血实验方法为以2%兔血红细胞混悬液与供试液混合，保温，目测溶血与凝聚的情况来做出判断或保温后离心取上清液进行UV测定并计算溶血率。笔者采用指纹图谱技术分析中药注射液中的成分，并结合溶血性实验结果进行相关分析，可以快速锁定溶血率较高的样品。此方法适用于成分复杂、未知成分多的中药研究，可以大大缩短研究时间，节约研究成本，是溶血性物质研究方法或模式的新尝试。

[1]常晓红，申丽萍，张藜莉，等.44例血塞通注射剂不良反应文献分析[J].中国医院用药评价与分析，2008，8(4)：304-305.

[2]彭辽宇，覃宗升，廖燕平.血塞通注射液不良反应83例分析[J].广西医学，2007，29(3)：394-395.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010：附录132.

[4]国家食品药品监督管理总局.中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[S].指导原则编号[Z]GPT4-1，2005.

Correlation Analysis on Hierarchical Cluster Analysis of Xuesaitong Injection`s Fingerprint and Hemolytic

CHENG Bin1ZHANG Hongyu1HE Daohui2WANG Li1

1.Yunnan Institute for Food and Drug Control, Kunming 650011,China;2.Center for Drug and Medical Device Evaluation,Kunming 650101,China

Objective To investigate HPLC fingerprint of Xuesaitong injection, get the result of hierarchical cluster analysis, and discuss the correlation analysis on hierarchical cluster analysis and hemolytic.Methods HPLC fingerprint of Xuesaitong injection was established, relative peak area of 10 sample were applied to grade by Hierarchical Cluster Analysis, and calculate hemolytic rate.Results The Xuesaitong injection could be divided into three grades through the result s of hierarchical cluster analysis, which it`s similar to hemolytic determination results.Conclusion The result of Xuesaitong injection`s fingerprint hierarchical cluster and hemolytic have a certain correlation.

Fingerprint;Hemolytic;Hierarchical cluster analysis

程宾(1976-)，男，汉族，硕士，副主任药师，研究方向为食品药品检验检测。E-mail: 46049141@qq.com

R927.11

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1007-8517(2017)15-0032-04

2017-05-31 编辑：程鹏飞)