安国地区荆芥资源的调查报告与分析

熊 蕊 郭凤柳 赵彩娟 刘晓慧 赵同欣 王 娜 孙宝山 颜 红

保定出入境检验检疫局，河北 保定 071051

资源调查

安国地区荆芥资源的调查报告与分析

熊 蕊 郭凤柳 赵彩娟 刘晓慧*赵同欣 王 娜 孙宝山 颜 红

保定出入境检验检疫局，河北 保定 071051

目的：调查安国地区荆芥的资源状况，为荆芥资源的保护及可持续利用提供科学基础和参考依据。方法：采用查阅文献资料、实地调查及鉴定等方法对安国地区荆芥的资源分布状况进行全面了解，提取样品基因组DNA，对ITS2和psbA-trnH序列进行PCR扩增及双向测序，所有序列用软件 DNAStar拼接，采用MEG6.0软件进行序列比对，计算其种内和种间 K2P 遗传距离，并构建邻接树。结果：安国地区荆芥集中分布在海拔23～36m，经度115°27′～115°16′，纬度38°32′～38°20′区域内的山坡路旁或山谷、林缘，目前主要以人工栽培为主。裂叶荆芥ITS2 序列长度为 497bp，与其混伪品种间K2P 最小距离为 0.060，psbA-trnH序列长度为 452bp，与其混伪品种间K2P 最小距离为 0.064，种间距离均大于其种内距离，邻接树显示可以将裂叶荆芥与其混伪品完全分开。结论：归纳概述了安国地区荆芥的地理分布、资源量、药用价值，ITS2 序列和psbA-trnH序列可鉴别荆芥及其混伪品，为荆芥的种质资源鉴定和可持续利用开发提出了切实可行的建议和措施。

荆芥；ITS2序列；psbA-trnH序列；地理分布；DNA条形码

荆芥为唇形科植物荆芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分[1]，是著名的八大祁药之一，其性味辛，微温，归肺、肝经。具有祛风解表、消疮、透疹及止血的功效。荆芥在我国分布广泛，临床上多应用栽培品。 河北安国和浙江萧山都是历史悠久的荆芥栽培基地[2]。由于中药材的产地、遗传因子、生态因子和栽培措施等因素均会对中药材的有效成分产生影响，从而造成不同来源中药材之间的差异。荆芥作为中国一味栽培历史悠久、药用范围广泛的植物，由于长期自种自繁和地区间的相互不科学引种，导致群体混杂、种质退化，其不同品种、不同产地生产出的药材质量良莠不齐，严重影响了荆芥药材的产量和品质。

随着中药现代化和国际化的进程，国内外对荆芥的研究逐渐广泛和深入，这对荆芥的产量和品质提出更高更严格的要求。荆芥属植物分布广泛、生态适应幅度大，且多型性及自然杂交现象普遍，导致该属植物在形态和化学上产生了很多变异，传统鉴定困难，因此在荆芥的生产中存在着品种混乱的现象，直接影响到荆芥临床用药的安全、疗效。目前，国内外对于荆芥的研究主要集中在化学成分、炮制和药理作用方面[3-5]，而关于其种质资源方面的报道较少。

DNA 条形码(DNA barcoding)技术是利用基因组中一段标准的、相对较短的DNA序列对物种进行准确鉴定的一种分子诊断新技术[6]，具有简便高效的特点，适用于中药材的真伪鉴定。目前已有芸蔷薇科、香科等多个药用植物丰富的植物科属开展了DNA 条形码研究并取得良好鉴定效果[7]。本文利用自身优势，建立了荆芥的DNA条形码方法，以期为该类药材的临床安全用药和可持续利用荆芥种质资源保护提供分子鉴定依据和保障。

1 研究范围和调查方法

1.1 调查方法 走访安国地区的药材公司、饮片加工企业、当地农业部门、药监部门、当地药农等，全面了解祁荆芥的当前资源产量；通过整理文献、查阅标本馆标本，以及走访安国市药材市场的市场信息人员，明确了安国地区荆芥主要分布区域，确定了祁州药市街道、西佛落乡、西安国城乡、石佛镇、北段村乡、明官店乡为主要调查区域。

1.2 DNA条形码技术鉴别 走访当地并采集祁荆芥样品，在查阅大量国内外植物DNA条形码文献的基础上，结合国内植物DNA条形码研究现状，选取CBOL推荐的作为陆地植物DNA条形码通用的两个片段：核基因ITS和叶绿体基因psbA-trnH作为荆芥样品的扩增引物。ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5’- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3’；反向引物ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。psbA-trnH序列扩增正向引物psbAF：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’。通过PCR技术获得祁荆芥ITS和psbA-trnH的PCR扩增产物，经凝胶回收纯化试剂盒回收纯化后送上海生物工程有限公司进行测序。序列校对后，在GenBank中进行BLAST比对分析，通过分析ITS2 和psbA-trnH基因的碱基序列，建立祁荆芥的DNA条形码技术。1.3 序列比对及系统发育分析 河北安国地区裂叶荆芥ITS序列和psbA-trnH序列经 BLAST 搜索，下载搜索到的裂叶荆芥，唇形科另外4个属植物：藿香属(Agastache)、青兰属(Dracocephalum)、扁柄草属(Lallemantia)、荆芥属(Nepeta) 以及土荆芥(Dysphania)、水荆芥(Elsholtzia ciliata)的ITS 和psbA-trnH全序列。以裂叶荆芥ITS和psbA-trnH序列为内群，以唇形科另外 4 个属植物的ITS和psbA-trnH序列为外群，使用 DNAStar软件对裂叶荆芥序列进行多序列比对，比对结果均用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-Joining) 进行系统发育分析，绘制系统发育树。

2 结果

2.1 种资资源 裂叶荆芥为一年生草本，高60～100cm，具有强烈香气。茎直立，四棱形，基部棕紫色，上部多分枝，全株被灰白色短柔毛。花期7～9月，果期9～11 月(图1、图2)。常生长于山坡路旁或山谷、林缘。通过我们的实地调查，发现在安国地区的祁州药市街道、西佛落乡、西安国城乡、石佛镇、北段村乡、明官店乡等区域均有大量的荆芥栽培(表1和图3)。

表1 荆芥分布状况

2.3 DNA条形码扩增结果与分析

2.3.1 中药材祁荆芥ITS和psbA-trnH序列的PCR电泳检测 从荆芥ITS和psbA-trnH序列PCR电泳图谱(图4、图5)可以看出PCR扩增结果都比较理想，均获得清晰规则的条带，无非特异性条带出现，表明这两对引物对荆芥样品基因组 DNA 均有很好的扩增效果。

由图4和图5可知，荆芥ITS2和psbA-trnH序列均可以用通用引物扩增出来，说明通用引物的通用性高，可用于荆芥中ITS2和psbA-trnH基因的扩增。这与线粒体DNA在细胞中比细胞核DNA拷贝量大有关。

表2 祁荆芥及其混伪品的样品信息

续表

表2 祁荆芥及其混伪品的样品信息

2.3.2 PCR扩增产物测序结果及分析 将所得片段回收、克隆、测序、校对后，在NCBI中经BLAST比对分析，结果表明，ITS2序列DNA片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Schizonepetatenuifolia基因(登录号：JN802670.1)的基因序列的相似性大于100%，psbA-trnH序列DNA片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的Schizonepetatenuifolia基因(登录号：AB728566.1)的基因序列的相似性大于99%，证明所得片段均为目的片段(图6和图7)。

2.3.3 遗传距离分析 从 GeneBank 中下载与裂叶荆芥同科不同属的唇形科另外 4 个属植物以及土荆芥和水荆芥的ITS和psbA-trnH基因序列。应用DNAstar序列分析软件进行基因序列比较，结果表明(见图8、9)：河北安国地区裂叶荆芥(Schizonepeta-ANGUO-HBANG008)与来自中国不同产地及不同国家的裂叶荆芥 ITS和psbA-trnH 序列一致性均较高，ITS序列一致性在97.9%～100%之间，而psbA-trnH序列一致性则在99.0%～100%。国内不同产地的裂叶荆芥ITS 序列一致性为99.4%～100%之间，psbA-trnH序列一致性为99.0%～100%之间。中、日、韩 3国裂叶荆芥 ITS 序列一致性为 100. 0%，中国裂叶荆芥与美国裂叶荆芥 ITS 序列一致性为 99.0%。由于GenBank中未收录日、韩、美3国的psbA-trnH序列，故未进行相关的基因序列比对。

不同植物的ITS和psbA-trnH序列进行对比分析，利用MEGA6.0 软件计算出物种间和物种内的遗传距离，从而达到区分不同物种的目的。从图8可以看出，7～13 号属于同种植物，遗传距离介于 0.000～0.018 之间，但是同属不同种植物之间的遗传距离为 0.060～0.101，最大的种内距离小于最小的种间距离；从图9可以看出，6～9 号属于同种植物，遗传距离为0.000，但是同属不同种植物之间的遗传距离为 0.064～0.081，最大的种内距离也小于最小的种间距离。因此，利用遗传距离可以将不同物种准确区分开。另外，随着亲缘关系的变远，裂叶荆芥与水荆芥、土荆芥的遗传距离很远，可以准确的将正伪品区分开。

2.3.4 构建 NJ 树进行物种鉴定 为了更直观地反映鉴定结果，本研究采用MEGA 6.0 软件的邻接法 (Neighbor-Joining)进行系统发育分析，绘制系统发育树，构建了 NJ 系统聚类树。基于 ITS 序列的遗传进化树可以看出(见图10)进化树以土荆芥和水荆芥为树根，由树根分出2 个分支。其中以河北安国地区裂叶荆芥为代表的中国裂叶荆芥与来自日、韩、美 4 国的裂叶荆芥以 99% 的置信度形成单系群，该单系群分为 2 个分支，中、日、韩 3 国的裂叶荆芥形成分支Ⅰ，美国的裂叶荆芥单独形成分支Ⅱ。裂叶荆芥与唇形科中的藿香属亲缘性最近，而与荆芥属的亲缘性较远。基于psbA-trnH序列的遗传进化树可以看出(见图11)：进化树以土荆芥和裂叶荆芥为树根，由树根分出2 个分支。其中裂叶荆芥不同来源样本均聚在一起，表现出单系性，可与其它密切相关物种明显区分开。

3 讨 论

中药荆芥是传统的辛温解表药物，全草和穗加工后具有祛风解表、宣毒透疹、散瘀止血之功效，常用于治疗感冒发热、头痛、咽喉肿痛及多种皮肤病。荆芥炒炭后专功止血，常在吐血、衄血、便血、崩漏、产后血晕等方面发挥作用，为中医临床常用中药材[8]。荆芥所含化学成分种类较多，目前从荆芥中分离鉴定了挥发油类、萜类、甾类、黄酮类及酚酸类等化合物。其中挥发油类为荆芥属植物的主要有效成分，此类研究报道也居多，研究表明其具有抗炎镇痛、去痰平喘、抗癌抗氧化等作用[9-10]。一般说来，荆芥各个部位的挥发油含量的顺序为：荆芥穗>荆芥>荆芥梗>荆芥炭。Mi-Hee Chun 等[11]应用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC/MS) 法分析出荆芥挥发油的主要成分为单萜酮类、单萜醇类和倍半萜。张丽等[12]对河北安国荆芥进行指纹图谱分析，建立了荆芥穗挥发油 HSGC 指纹图谱。

因安国市部分地区的地形地势、气候、土壤条件适宜荆芥的生长，本市辖区内的广大人民群众，长期以来利用荆芥来治疗皮肤病、妇科病、流行性感冒等等极为普遍。现有荆芥研究多集中在化学成分、药理作用和临床应用等方面，有关种质资源多样性、不同种质之间鉴定等方面研究尚属空白。

DNA 条形码是目前国际上最新物种鉴定技术，通过构建中药材 DNA 条形码技术鉴定体系，可以实现对中药材原植物、饮片、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确快速鉴定，该技术易于掌握，便于推广，对缓解传统鉴定人才缺乏、药材鉴定困难、确保中药材的安全有效均具有重要的现实意义。本研究利用 ITS2 和psbA-trnH条形码对裂叶荆芥、唇形科另外 4 个属植物、土荆芥和水荆芥等中药材进行系统的比较鉴别，旨为该类药材的质量控制及临床安全用药提供分子鉴定依据和保障。

从遗传距离可以看出，河北安国地区裂叶荆芥与来自中国不同产地及不同国家的裂叶荆芥 ITS和psbA-trnH 序列一致性均较高，ITS序列一致性达97.0%以上，psbA-trnH 序列一致性则达99.0%以上，虽然序列中有一些碱基的变异，但这种变异未超过一个种范围内的变异。不同地区同一物种之间的碱基序列变异少，遗传距离小；而不同物种之间的碱基序列变异大，遗传距离大，且最大的种内距离小于最小的种间距离。裂叶荆芥、藿香属、青兰属、扁柄草属和荆芥属属于唇形科的不同属，他们之间的遗传距离较远；土荆芥为藜科植物，与裂叶荆芥的亲缘关系较远，遗传距离也很远。说明亲缘关系越远，遗传距离越大。因此，可以利用遗传距离精确地将不同物种分开。

植物的分布和系统发育一般与地理位置存在一定的关系[13]。从建立的系统发育邻接树也可以看出，裂叶荆芥的聚类结果与实际地理位置相符。中、美、日、韩 4 国的裂叶荆芥根据地理位置分为2 个分支，说明裂叶荆芥的种间变异主要受地理位置的影响。而且裂叶荆芥不同来源样本均聚在一起，表现出单系性，可与其他密切相关物种明显区分开。邻接树和遗传距离反映的结果一致，说明ITS和psbA-trnH序列可作为裂叶荆芥的 DNA 条形码。

4 资源保护和持续合理利用建议

荆芥应用历史悠久，原为野生，现临床上所应用的多为人工栽培，市场上主要流通的是河北安国、玉田等地的生产种质。由于长期自种自繁、不科学引种，导致群体混杂、种质退化，影响了荆芥药材的产量和品质[14]。近年来对荆芥的有关研究主要集中在化学成分、炮制方法、药理作用和临床应用等方面，而对荆芥种质资源的多样性、不同种质之间鉴定等方面研究较少[15]。对于植物中药材的品种鉴定还停留在药材性状、显微特征等传统方法上，费时、费力、重复性差，准确度低。另外，对于荆芥的药理作用多见于抗炎除菌方面，化学成分的研究又多集中在挥发油类物质，而对解热止血和非挥发油成分等方面的研究较少。

在开发利用的同时，对药用植物资源的保护管理应加大力度。首先应多形式广泛宣传保护资源的重要意义，提高认识[16]，加强对药用植物的宣传力度，树立起可持续发展的思想观念；其次采取有力措施，合理利用植物中药资源，保证药材的优良种质；再次随着新的鉴定技术在中药材鉴定方面的普及，今后应该着力开展除传统方法以外的研究技术，比如通过指纹图谱、分子生物学技术等现代鉴定手段对荆芥种质进行鉴定；最后应加大其它主要有效成分的研究力度，为提高中药材质量，保证临床用药安全和有效提供保障[17]。

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Investigation Report onSchizonepetaetenuifoliaResources in Anguo Area

XIONGRui GUO Fengliu ZHAO Caijuan LIU Xiaohui*ZHAO Tongxin WANGNa SUN Baoshan YANHong

BaoDing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Bao ding 071051， China

Objective To investigate resources ofSchizonepetaetenuifoliain Herba，so as to provide reference for local resource protection and reasonable development and use. Methods To investigate the resources of theSchizonepetaetenuifoliain Herba Province, literature retrieval, on-the-spot investigation, visiting, gathering identification, specimen collection, classification and identification were carried out. The DNA was extracted from the samples、TS2 and psbA-trnH was amplified and sequenced. Sequence assembly was performed using the DNAStar. The genetic distances and vayiable sites of ITS and psbA-trnH region were analyzed using MEG6.0 after sequence alignmeng, and the phylogenetic tree was constructed by the neighbor joining method. Results TheSchizonepetaetenuifoliain Herba Province mainly were widely distributed, altitude 23～36m, longitude 115°27′～115°16′, latitude 38°32′～38°20′, within the area of hillside or valley, forest edge. At present, it is mainly by artificial cultivation. The sequence length of the ITS2 ofSchizonepetaetenuifoliawas 497bp, and the results showed that the minimum inter-specific divergence was 0.060; The sequence length of the psbA-trnH of Schizonepetae tenuifolia was 452 bp, and the results showed that the minimum inter-specific divergence was 0.064, which was larger than the maximum intra-specific divergence. The phylogenetic tree indicated thatSchizonepetatenuifoliacould be distinguished from its adulterants obviously. Conclusion Combined with the litersture, effective suggestions measures of theSchizonepetaetenuifoliain Herba Province. ITS2 and psbA-trnH indicated thatSchizonepetatenuifoliacould be distinguished from its adulterants obviously. Meanwhile, some suggestions and measures were put forward for protection and reasonable development of plant resources of Schizonepetae tenuifolia.

Schizonepetatenuifolia; ITS Sequence; PsbA-trnH Sequence ; Geographical Distribution; DNA Barcoding

河北出入境检验检疫局自主立项项目(HE2014K043)。

熊蕊 (1982-)，女，汉族，硕士研究生，中级兽医师，研究方向为动物检疫和食品微生物学。E-mail: xiongrui1982126@126.com

刘晓慧(1980-)，女，汉族，博士研究生，兽医师，研究方向为动物检疫和食品微生物学。E-mail: drlxh@163.com

R282.71

A

1007-8517(2017)16-0136-07

2017-06-07 编辑：陶希睿)