槲皮素对异烟肼联用利福平致大鼠肝损伤的防护作用

魏 来，赵春景

（重庆医科大学附属第二医院药剂科，重庆 400010）

·实验研究·

槲皮素对异烟肼联用利福平致大鼠肝损伤的防护作用

魏 来，赵春景

（重庆医科大学附属第二医院药剂科，重庆 400010）

目的 观察槲皮素对异烟肼（INH）和利福平（RFP）联用致大鼠肝损伤的防护作用，并探讨其作用机制。方法 选择雄性Wistar大鼠50只，自由进食饲料和水，适应性喂养1周后，按随机数字表法分为空白对照组，肝损伤模型组和槲皮素低、中、高剂量组，各10只。除空白对照组外，其余组大鼠每天一次性给予异烟肼和利福平各 75 mg／kg，用药 4周制备大鼠肝损伤动物模型，空白对照组仅给予等体积生理盐水，槲皮素低、中、高剂量组给予INH和RFP 2 h后，分别给予低、中、高剂量（50，100，200 mg／kg）槲皮素，空白对照组和肝损伤模型组均灌胃等体积的蒸馏水。4周后，测定大鼠血清中天门冬酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和总胆红素（TBIL）的水平，肝脏指数，以及肝组织匀浆中的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并作肝组织病理学检测。结果 槲皮素能降低大鼠肝脏指数，AST，ALT和TBIL及肝匀浆中MDA水平，升高肝匀浆中GSH及SOD水平（P＜0.05），还能减轻肝组织变性和坏死程度，缓解肝组织损伤的病理改变。结论 槲皮素对INH和RFP联用所致大鼠肝损伤有保护作用，其作用机制可能与槲皮素抑制脂质过氧化反应有关。

槲皮素；大鼠；肝损伤；异烟肼；利福平；作用机制

异烟肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampin，RFP）均为临床一线抗结核药，目前，在世界卫生组织（WHO）推荐的抗结核化学治疗（简称化疗）标准方案[1]及衍生方案中仍不可替代。两药对繁殖期和静止状态的结核杆菌均有较强作用，且联用有协同作用，可增强杀菌效果，但会增加肝毒性，甚至出现严重的肝功能障碍[2]，其致肝损伤的机制尚不清楚[3]。目前的研究认为，异烟肼的肝毒性与其代谢产物肼及单乙酰衍生物有关；利福平则通过诱导肝药酶活性，导致乙酰肼代谢的活性中间体增多而加重异烟肼的肝毒性[4]。如何防治肝损伤已成为抗结核化疗亟待解决的问题。槲皮素（quercetin）为五羟基黄酮类化合物，不溶于冷水，难溶于热水，溶于碱溶液，已证实其具有抗氧化、抗血小板聚集、降压等多种药理作用[5－7]，且已观察到槲皮素对四氯化碳（CCl4）所致大鼠肝损伤有防护作用[8]，但有关槲皮素对结核药所致肝损伤的防护作用未见报道。对此，本研究中观察了INH和RFP联用致肝损伤大鼠在给予槲皮素后各指标的变化，以此探讨槲皮素对INH和RFP联用致肝损伤的保护作用及其作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试药

动物：Wistar大鼠 50只，雄性，清洁级，体质量180～200 g，鼠龄6～7周，购于重庆医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号为 SYXK（渝）2012－0001。饲养条件：温度 21～26℃，相对湿度 40% ～70%，10／14 h明暗交替照明。

仪器：AEG－220型电子天平，UV－1601型紫外分光光度计（日本岛津公司）；J2－MC型低温离心机（美国Beckman公司）；MDF－U333型低温冰箱，日本Sanyo公司）；7070型全自动生化分析仪（日本日立公司）；玻璃匀浆器（规格为20 mL，涿州市长虹玻璃仪器厂）。

试药：槲皮素（南京标科生物科技有限公司）；异烟肼片（西南药业有限公司，批号为091124）；利福平胶囊（重庆科瑞制药有限公司，批号为100228）。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号为20100412），丙二醛（MDA）试剂盒（批号为 20100829）和谷胱甘肽（GSH）试剂盒（批号为20100923），均购自南京建成生物工程研究所。

1.2.1 造模及分组

大鼠自由进食饲料和水，适应性喂养1周后，按随机数字表法分为空白对照组，肝损伤模型组和槲皮素低、中、高剂量组，各10只。槲皮素临用前用生理盐水配成质量浓度为10 g／L的溶液灌胃治疗4周。空白对照组和肝损伤模型组按体质量换算等体积生理盐水灌胃4周。INH直接溶于无菌注射用水，制成质量浓度为30 g／L的灌胃液，RFP溶于pH＝3.0的盐酸溶液，制成质量浓度为30 g／L的灌胃液[9]。除空白对照组外，其余4组大鼠每天一次性灌胃INH和RFP各75 mg／kg，连续4周，灌胃体积为20 mL／kg，以制备肝损伤模型，INH和RFP用量为人用剂量的 5.5倍[10－11]。空白对照组则灌胃等体积生理盐水。在给予INH和RFP 2 h后，槲皮素低、中、高剂量组分别灌胃 50，100，200 mg／kg槲皮素，空白对照组和肝损伤模型组均灌胃等体积的蒸馏水，各组灌胃体积均为20 mL／kg，每天1次，连续给药4周。

1.2.2 标本采集及制备

全部动物于末次给药后禁食不禁水12 h，乙醚麻醉，眼眶取血。摘取肝脏，称定质量，然后取部分肝脏用生理盐水漂洗数次后，滤纸拭干，精确称取0.5～0.6 g，加入4℃生理盐水5～6 mL，倒入玻璃匀浆器中，放入冰水中碾磨，制成10%肝匀浆，4℃下以10 000 r／min的速率离心30 min，取上清液分装，保存于－70℃冰箱中，待测。另取部分肝叶，用4℃生理盐水漂洗数次后，迅速用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，苏木素－伊红（HE）染色，作肝脏病理组织学检查。

1.3 观察指标[9]

一般状态：观察大鼠的一般情况，包括精神、运动、饮食、排便、皮毛色泽、死亡等情况，每周称定大鼠体质量，记录其变化。

肝脏指数：肝脏指数（mg／g）＝肝质量（mg）／体质量（g）。

肝脏损伤程度：“－”为正常；“＋”表示变性是以肝细胞质疏松化为主，变性的肝细胞占肝细胞总数的1／3以下，坏死以单个或几个肝细胞坏死为主，占肝细胞总数的10%以下，炎性细胞浸润每个高倍视野0～10个；“＋＋”表示变性是以肝细胞气球样变为主，变性的肝细胞占肝细胞总数的1／3～1／2，坏死以肝细胞小片状坏死为主，占肝细胞总数的10%～20%，炎性细胞浸润每个高倍视野10～20个；“＋＋＋”表示变性是以肝细胞气球样变为主，变性的肝细胞占肝细胞总数的1／2以上，坏死以肝细胞大片坏死为主，占肝细胞总数的20%以上，炎性细胞浸润每个高倍视野20个以上。每张病理切片随机取3个视野，取平均值。“－”按0分计算，“＋”按0.1分计算，“＋＋”按0.2分计算，“＋＋＋”按0.3分计算[11]。

处于成长期内的农作物，如果不防控各类作物病虫害，则会存在较大可能威胁到作物的存活与生长。严重的情形下，欠缺全方位的病虫害防控还将会引发减产，并且损害当地农户的经济收益。在当前阶段中，针对防治病虫害可以选择灵活性的防控措施，其中包含生物手段、化学手段及其他防治举措。防治农作物感染各类病虫害的举措应当建立于绿色植保的基础上，确保将保护农作物的思路全面融入防控病虫害的流程与环节中。

肝功能：大鼠眼眶取血约2 mL，用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）和总胆红素（TBIL）水平，并判断其活性。

肝匀浆检测：按试剂盒说明检测肝匀浆中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

空白对照组大鼠精神状态良好，摄食正常，皮毛有光泽，粪便及尿液等均无异常；肝损伤模型组大鼠出现不同程度皮毛蓬乱，粪便、尿液呈橘红色改变；槲皮素各剂量组大鼠一般情况优于肝损伤模型组。整个实验过程中无大鼠死亡。

2.2 对肝功能的影响

与空白对照组比较，肝损伤模型组大鼠血清中AST，ALT和TBIL活性均明显升高（P＜0.01或 P＜0.05）、肝脏指数明显增大；与肝损伤模型组比较，槲皮素低、中、高剂量组肝脏指数均降低（P＜0.05或 P＜0.01），槲皮素各剂量组血清中ALT及TBIL的活性明显降低（P＜0.05或 P＜0.01），槲皮素高剂量组AST水平的升高明显受抑（P＜0.05）。详见表1。

2.3 对肝脏形态学的影响

空白对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞形态正常，肝细胞索清晰，围绕中央静脉呈放射状排列，肝窦及汇管区无异常，基本无炎性细胞浸润；肝损伤模型组可见肝小叶失去正常的条索状排列，胞浆疏松呈网状，核深染。大部分细胞浊肿，中央静脉周围部分肝脏细胞发生气球样变。嗜酸性变、点状坏死病灶并见炎性细胞浸润。与空白对照组相比，肝损伤模型组病理损伤明显（P＜0.05）；与肝损伤模型组比较，槲皮素各剂量组的大鼠肝脏病理损伤程度明显减轻（P＜0.05）。详见表2及图1。

表1 槲皮素对大鼠肝功能的影响比较（±s，n＝10）

表1 槲皮素对大鼠肝功能的影响比较（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较， P＜0.05， P＜0.01；与肝损伤模型组比较， P＜0.05， P＜0.01。表3同。

组别空白对照组肝损伤模型组槲皮素低剂量组槲皮素中剂量组槲皮素高剂量组剂量[mg／kg·d）]－INH 75＋RFP75槲皮素50＋INH 75＋RFP 75槲皮素100＋INH 75＋RFP 75槲皮素200＋INH 75＋RFP 75肝脏指数（mg／g）34.26±6.25 55.53±8.45 51.33±5.58 46.78±6.27 42.32±5.36 AST（U／L）235.20±29.46 450.80±39.30 368.90±41.30 305.60±40.55 288.10±37.66 ALT（U／L）49.40±10.32 69.80±12.44 55.60±7.87 34.70±7.44 32.30±6.58 TBIL（ mol／L）8.50±2.36 15.05±3.25 13.88±3.68 12.82±2.24 11.79±2.71

表2 槲皮素对大鼠肝脏病理改变和损伤程度分级的影响（n＝10）

图1 光学显微镜下的肝脏病理组织（HE，×200）

2.4 对肝组织匀浆中MDA，GSH和SOD水平的影响

与空白对照组比较，肝损伤模型组MDA的水平明显升高（P＜0.01），SOD活性明显降低（P＜0.05），GSH含量明显降低（P＜0.05）；与肝损伤模型组比较，槲皮素的中、高剂量组MDA水平降低，GSH水平升高（P＜0.05或 P＜0.01），槲皮素各剂量组SOD水平均升高（P＜0.05或 P＜0.01）。详见表3。

3 讨论

INH在肝脏被乙酰化为乙酰异烟肼，乙酰异烟肼又可被进一步氧化为乙酰肼，后者达一定浓度即可损伤肝细胞。RFP本身无毒，主要是通过累及肝内胆红素的正常分泌代谢过程而导致胆红素升高，但RFP自身可诱导CYP2E1的活性升高，通过协同作用加重INH所引起的肝损伤[12]。本研究中在确定肝损伤模型建立后，发现槲皮素低、中、高剂量组大鼠的肝脏指数和ALT、AST、TBIL水平均有不同程度下降，且与槲皮素剂量呈负相关（P＜0.05或 P＜0.01）。说明槲皮素对肝脏损伤具有一定预防和改善作用。

表3 槲皮素对肝损伤大鼠肝组织匀浆中MDA，GSH和SOD水平的影响（±s，n＝10）

表3 槲皮素对肝损伤大鼠肝组织匀浆中MDA，GSH和SOD水平的影响（±s，n＝10）

组别空白对照组肝损伤模型组槲皮素低剂量组槲皮素中剂量组槲皮素高剂量组剂量[mg／(kg·d）－INH75＋RFP75槲皮素50＋INH75＋RFP75槲皮素100＋INH75＋RFP75槲皮素200＋INH75＋RFP75 MDA（ mol／g）2.54±0.56 3.77±0.70 3.38±1.28 3.10±1.37 2.87±1.31 GSH（mg／g）104.47±28.32 76.50±17.46 91.36±24.55 93.57±19.71 94.58±18.94 SOD（U／mg）160.54±7.72 107.70±8.75 113.42±14.66 127.66±14.87 143.22±13.59

高浓度的活性氧是抗结核药物在肝脏中代谢的产物，通过损伤细胞膜的结构诱导氧化应激反应导致机体损伤。脂质过氧化是氧化应激的重要标志，它在INH和RFP诱导的肝脏损伤中发挥着重要作用[13－15]。SOD是超氧阴离子自由基的清除剂，能抑制黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，减少自由基产生，减轻肝细胞损伤，抑制自由基启动的脂质过氧化反应。而MDA是脂质过氧化反应中分解的终产物之一，能使膜蛋白、酶发生交联反应，使膜通透性增加，导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，对机体造成损害。因此，SOD和MDA水平的高低不仅能反映肝细胞膜脂质过氧化的强弱，还可间接反映机体组织、细胞损伤的程度。GSH可清除O2－，缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒或加重其中毒作用，这可能与增加氧化损伤有关，GSH水平是衡量机体抗氧化能力的重要因素[11]。本研究中通过检测大鼠肝组织中MDA，GSH，SOD的活性来评价肝脏脂质过氧化损伤的程度，结果显示，肝损伤模型组与空白对照组相比，肝组织中MDA水平升高，GSH和SOD水平降低，提示INH和RFP进入大鼠体内后会引起肝内GSH水平及抗氧化能力的下降，导致氧化应激反应，并引起肝内脂质过氧化，从而导致肝损伤，表明脂质过氧化与肝损伤的发病机制有关；而槲皮素的不同剂量组与肝损伤模型组相比，槲皮素能明显降低MDA水平，提高GSH和SOD水平，说明槲皮素可通过抑制脂质过氧化反应，对INH和RFP联用所致的大鼠肝损伤有一定防护作用。

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Protective Effects and Mechanisms ofQuercetin on Hepatic Injury Induced by Isoniazid Combined with Rifampicin in Mice

Wei Lai，Zhao Chunjing
（Department of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing，China 400010）

Objective To investigate the protective effect and mechanism of quercetin on liver injury induced by isoniazid（INH）combined with rifampicin （RFP）in rats.Methods Totally 50 male Wistar mice were fed with feed and water，and 1 week after adaptive feeding，the mice were randomly divided into blank control group，liver injury model group and quercetin low，middle and high dose groups，10 mice in each group.In addition to the blank control group，the mice in the other groups were given INH and RFP（each 75 mg／kg）per day for 4 weeks to prepare the animal models of liver injury in mice，and the blank control group was given equal volume of normal saline，2 h after giving INH and RFP，the low，middle and high dose groups were given low dosage，middle dosage and high dosage of quercetin（50，100，200 mg／kg），the blank control group and the liver injury model group were filled with equal volume of distilled water.The serum levels of AST，ALT and TBIL，liver index，contents of MDA，GSH，and SOD in liver were measured after 4 weeks of giving quercetin，and the hepatic pathological changes were also observed.Results Quercetin could reduce the liver index，the serum level of AST，ALT，TBIL and the content of MDA，raise the liver GSH content，promote the the activities of SOD in liver in mice.The degeneration and necrosis of liver tissue were relieved，and the pathological changes of liver tissue injury were alleviated.Conclusion Quercetin has the protective effect on the hepatotoxicity induced by INH combined with RFP in mice，and the mechanism may be related to the inhibition of lipid peroxidation of quercetin.

quercetin；mice；hepatotoxicity；isoniazid；rifampicin；mechanism of action

R965

A

1006－4931(2017)16－0009－04

2017－04－09；

2017－05－26)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.16.003

重庆市医学科研项目[2010－2－143]。

魏来，女，硕士研究生，研究方向为临床药理学及临床药学，（电话）023－63693137（电子信箱）501760092＠qq.com。