NF—kB在肝癌中表达及其与上皮间质转化的关系

卢穗万+曾文龙+阙敢波+简以增+余强锋+张洪彬+黄腾钦+潘伟华+陈煌祥

[摘要] 目的 探讨核转录因子NF-kB在肝癌中的表达情况及其与肝癌上皮间质转化（EMT）的关系。方法 （1）方便收集福建省龙岩市第二医院2014年12月—2015年10月肝癌患者12例外周血样本，采用CanPatrol CTC二代富集技术分离循环肿瘤细胞（CTCs）；②采用RNA原位杂交（RNA-ISH）技术，鉴定CTCs类型和检测NF-kB的表达。结果 91.7%（11/12）肝癌患者外周血样本中检测出CTCs，根据EMT标志物，CTCs可被分为3个亚群，包括上皮型CTCs，上皮/间质混合型CTCs和间质型CTCs。间质型CTCs、NF-kB在肝癌外周血中表达率分别为66.7%（8/12）、83.3%（10/12）；NF-kB表达与CTCs检出率、间质型CTCs表达显著相关（P<0.05）。结论 NF-kB可能和肝癌的EMT发生有关，并促进肿瘤转移。

[关键词] 肝癌；NF-kB；循环肿瘤细胞；EMT

[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）06（b）-0019-03

[Abstract] Objective To study the expression of NF-kB in liver cancer and correlation with epithelial-mesenchymal transition. Methods Convenient selection The peripheral blood samples of 12 cases of liver cancer patients admitted and treated in our hospital from December 2014 to October 2015 were collected and the CTCs was isolated by the CanPatrol CTC second-generation enrichment technique， and the CTCs type was identified by the RNA-ISH and the expression of NF-kB was tested. Results The CTCs was tested in the peripheral blood samples of 91.7%（11/12） liver cancer patients， and CTCs could be divided into three subgroups according to the marker of EMT， including epitheliated type CTCs， epithelial / interstitial mixed type CTCs and interstitial type CTCs， and the expression rate of interstitial type CTCs and NF-kB in the peripheral blood of liver cancer was respectively 66.7%（8/12）and 83.3%（10/12）， and the expression of NF-kB was obviously correlated with the test rate of CTCs and expression of interstitial type CTCs（P<0.05）. Conclusion NF-kB may be related to the occurrence of EMT of liver cancer and promote the neoplasm metastasis.

[Key words] Liver cancer； NF-kB； Circulating tumor cell； EMT

循環肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，CTCs的出现是发生远处转移的前提，是形成转移灶的关键环节。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT），因此，根据EMT标志物，CTCs可被分为：上皮型CTCs，上皮/间质混合型CTCs和间质型CTCs，其中间质型CTC具有更强的转移潜能。核转录因子NF-kB可激活细胞因子或其受体基因转录，促进了非调节性淋巴细胞的生长而阻断凋亡[1]。近来研究表明，NF-kB不仅可导致肿瘤的发生，还与肿瘤浸润、转移存在密切关系。该研究方便收集福建省龙岩市第二医院2014年12月—2015年10月肝癌患者12例外周血样本，旨在应用CanPatrol CTC二代富集技术联合RNA原位杂交技术分离和鉴定肝癌患者CTCs，并检测NF-kB在肝癌中的表达，进一步分析NF-kB与肝癌EMT的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究方便收集了福建省龙岩市第二医院肝癌患者12例，男5例，女7例，年龄22～93岁，中位年龄58.5岁，全部病例经组织病理学检查确诊为肝癌。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 分型杂交探针、NF-kB检测探针由上海生工公司合成；154 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA、4%多聚甲醛溶液、PBS、DAPI、0.1×SSC、30%马血清、1.5%SDS、3 mM Tris-HCl （pH=8.0）。

1.2.2 样本采集 严格消毒后，应用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管采集肘正中静脉血5 mL静脉血，采集后置于4℃保存并于4 h内富集分离肿瘤细胞。

1.2.3 分离富集CTCs与检测 将血液样本从采血管转移到样本保存管中，室温放置30 min后，离心去除上清，固定剂固定8 min，使用滤膜滤法富集得到CTCs。采用RNA-原位杂交法（RNA-ISH）检测CTCs上皮标志物、间质标志物和NF-kB mRNA。

1.2.4 CTCs的判定标准 及阳性定义形态学标准：①细胞呈圆形、椭圆形或长形，直径大于10 μm；②光镜下可见完整细胞形态及细胞核；③荧光下细胞形态及边缘完整。RNA-ISH阳性信号标准：结果判定：由两位经培训实验员在荧光显微镜下分别观察细胞显色情况，按照以上标准采集阳性细胞图像并计数。若存在分歧，则由第三人或更多协助下共同判定结果。阳性界定值：目前尚无国际标准化CTCs的阳性界定标准，该研究以CTCs≥1判定为CTCs阳性结果。

1.2.5 CTCs分型标准 根据EMT标志物，将CTCs分为：上皮型CTCs，上皮/间质混合型CTCs和间质型CTCs。上皮型CTCs：上皮标志物阳性；上皮/间质混合型CTCs：上皮标志物和间质型标志物阳性；间质型CTCs：间质型标志物阳性[2-3]。

1.2.6 NF-kB阳性表达判定标准 NF-kB阳性信号点呈紫色，位于细胞核内。阳性细胞数≥1即为NF-kB阳性表达。

1.3 统计方法

所有数据经SPSS 19.0统计学软件处理，相关性评价采用Spearman双变量相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC检测结果

12例肝癌患者外周血样本中，有11例检出CTCs，阳性率为91.7%（11/12），CTCs数量为1～26个，中位数6个。根据EMT标志物，CTCs可被分为3个亚群，包括上皮型CTCs，上皮/间质混合型CTCs和间质型CTCs。其中，8例肝癌患者外周血中检出间质型CTCs，表达率为66.7%（8/12）。

2.2 NF-kB表达

NF-kB mRNA主要定位于细胞核，呈紫色信号点。在12例肝癌患者外周血样本中NF-kB阳性表达10例，阳性表达率为83.3%（10/12）。

2.3 NF-kB表达与肝癌患者CTCs、间质型CTCs表达关系

对12例肝癌患者的NF-kB表达与CTCs、间质型CTCs表达关系进行统计学分析，结果表明，NF-kB阳性表达与CTCs检出率、间质型CTCs阳性表达率均存在显著正相关性（r=0.674，P<0.05；r=0.632，P<0.05），見表1。

3 讨论

循环肿瘤细胞（CTCs）被称为肿瘤转移复发的“种子”，与肿瘤患者病情恶化密切相关。虽然血液中检测到CTCs并不代表着必定形成转移灶，但CTCs的数量及生物学状态可为临床治疗和用药提供重要依据，有助于尽早发现转移复发高危人群，加强这部分患者的随访并及时采取相应的治疗措施，对减少肿瘤的转移复发、提高患者生存率具有重要意义[2]。

CTC检测一般包括两个过程：分离和鉴定，目前CTCs检测技术很多，其中又以依赖肿瘤细胞表面上皮特异性粘附分子（EpCAM）表达而富集和鉴定CTC的方法为常见，如美国食品药监局（FDA）审批通过的CellSeach系统。但是，CTCs发生上皮间质转化（EMT）及其异质性使得传统的依赖上皮特异性抗原表达来鉴定CTC的方法应用受到限制，只能检测到EpCAM阳性的细胞，而无法检测EpCAM阴性的细胞[3-6]。

与基于表皮标志物的CTC检测技术相比，CanPatrol CTC二代富集技术具有更高的灵敏度，在5 mL血液样本中可检测到更多的CTCs，不仅可以检测到上皮型CTCs，还可以检测到间质型及上皮/间质混合型CTCs[7-8]。Zhao[8]应用CanPatrol CTC二代富集技术对1 203例结直肠癌患者的CTCs进行计数与分型，在1 046例患者中检出CTCs，检出率为86.9%，而CellSeach系统检出率约为5%左右。该研究采用CanPatrol CTC二代富集技术，先使用过滤的方法分离CTCs，然后基于分支DNA信号扩增技术进行RNA原位杂交（RNA-ISH），通过EMT标志物对不同癌种中的CTCs进行了EMT分型，12例肝癌患者外周血样本中，有11例检出CTCs，检出率为91.7%（11/12）。其中，8例肝癌患者外周血中检出间质型CTCs，表达率为66.7%（8/12）。该结果证实了CanPatrol CTC二代富集技术具有高检出率及可更全面检测所有类型CTCs的特点。

NF-kB是由RelA（P65）、RelB、C-Rel、NF-kB1（P50）、NF-kB2（P52）组成，其编码的产物由同源和各种异源的NF-kB/Rel蛋白二聚体构成，多为P50和P65，通过与其抑制蛋白IkB结合，参与下游信号转导通路，激活一系列激酶，从而调控相关基因表达[1]。

NF-kB不仅参与了肿瘤的发生，而且与肿瘤转移相关。徐沙沙等[9-10]报道了非小细胞肺癌（NSCLC）中NF-kB的表达与EMT密切相关，NF-kB可能协同Slug抑制E-cadherin表达，促进Vimentin表达，诱使NSCLC的EMT发生；此外，NF-kB还与分化程度（χ2=5.024，P<0.05）、有无淋巴结转移（χ2=6.174，P<0.05）及肿瘤的分期（χ2=7.317，P<0.01）有关。

该研究观察了NF-kB与CTCs的关系，初步研究表明肝癌外周血中NF-kB阳性表达与CTCs检出率、间质型CTCs阳性表达率具有一定相关性，未来的研究应扩大样本量并对患者进行随访观察，进一步探讨NF-kB、CTCs与肝癌患者临床病理特征及预后之间的关系，以期研究NF-kB、CTCs在肝癌诊断、治疗及预后的临床价值。

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（收稿日期：2017-03-16）