高效液相色谱—串联质谱同时测定粪箕笃中小檗碱和千金藤素含量

2017-09-04白丽丽戴华程莎孔杜林

中国医药导报 2017年21期

白丽丽++++++戴华++++++程莎++++++孔杜林

[摘要] 目的建立高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定海南粪箕笃中小檗碱和千金藤素含量的方法。方法色谱柱Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A（2.0 mm×50 mm，4 μm）；流动相为水（0.1‰甲酸，A相）-甲醇（0.1‰甲酸，B相）；柱温40℃，流速为0.35 mL/min，梯度洗脱。采用电喷雾正离子模式电离，选择多重反应监测模式进行检测。结果小檗碱和千金藤素在5.0～1000.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数> 0.98；小檗碱的平均回收率为101.46%～104.76%，相对标准偏差（RSD）为2.14%；千金藤素的平均回收率为95.96%～104.39%，RSD为4.63%；测得文昌、兴隆两地粪箕笃中小檗碱和千金藤素分别为0.889、1.07 μg/g和7.62、38.0 μg/g。结论 HPLC-MS/MS具有简单、分析速率快、灵敏度高等优点，适用于粪箕笃及千金藤属植物中生物碱的定量分析。

[关键词] 粪箕笃；高效液相色谱-串联质谱法；生物碱；含量测定

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0145-03

[Abstract] Objective To establish a method for the simultaneous determination of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Methods The separation of the analytes were carried out on a Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A column （2.0 mm×50 mm， 4 μm） using methanol containing 0.1‰ formic acid as mobile phase， the column temperature was 40℃， flow rate was 0.35 mL/min， gradient elution. HPLC-MS/MS was performed in multiple reaction monitoring mode via positive electrospray ionization （ESI+）. Results The calibration curves showed good linearity over the tested range from 5.0 to 1000.0 ng/mL for 2 compounds （the correlation coefficients> 0.98）.The recoveries and the relative standard deviations of berberin and cepharanthine was 101.46%-104.76%， 2.14% and 95.96%-104.39%， 4.63% respectively. The content of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. from Wenchang， Xinglong 2 areas were 0.889， 1.07 μg/g and 7.62， 38.0 μg/g. Conclusion The method is simple， fast and highly sensitivity， which can be used to control the quality of alkaloids from Stephania longa L..

[Key words] Stephania longa L.； HPLC-MS/MS； Alkaloids； Content determination

糞箕笃（Stephania longa L.）为防己科千金藤属植物，多年生草质藤本。在我国福建、广东、海南等地区有广泛分布，是天然的南药资源[1]。具有清热解毒、消肿利湿、袪风活络、抑菌、镇静和镇痛等功效[2-7]。该属药用植物繁多，富含生物碱，主要有可扑碱型、阿扑碱类，原小檗碱类，莲花烷类生物碱、双苄基异喹啉类、吗啡二烯酮型等。有关粪箕笃中生物碱的分离、结构鉴定及化学合成均有报道[8-12]，生物碱含量测定的方法很多[13-18]，但采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对粪箕笃生物碱进行定性定量分析尚未有报道。为寻找千金藤属植物中有用的生物碱资源，本文通过对海南文昌、兴隆粪箕笃根茎中的两种生物碱进行含量测定，建立HPLC-MS/MS定性定量分析方法，为粪箕笃及其千金藤属植物的开发利用提供一定的理论指导。

1 仪器与试药

1.1 仪器

仪器：API4000+串联四级杆质谱仪（AB Sciex公司，美国），通过Turbo V离子源接口与岛津公司Prominence UFLC液相色谱仪串联。AB-SCIEX软件控制数据采集和处理；液质联用仪LC-MS专用氮气发生器（NitroFlowLab，美国）；离心机（Sigma，德国）；分析天平（北京赛多利斯公司）；超纯水器（Millipore公司）；紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）。

1.2 试药

小檗碱（批号110713-201613）和千金藤素（批号111647-200301）对照品（中国食品药品检定研究所）；甲醇（HPLC级，国药集团化学试剂有限公司），乙腈为优级纯（Tedia，美国）；其他药品均为分析纯，水为超纯水。

粪箕笃采自海南文昌、兴隆，由海南医学院曾念开教授鉴定为防己科（Menispermaceae）千金藤属（Stephania）粪箕笃，阴干，粉碎成细粉备用。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取适量小檗碱和千金藤素于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度配制成1 μg/mL标准储备液，于4℃冰箱中储存。

2.2 供试品溶液及样品的制备

精密称定恒温干燥的粪箕笃粉末2 g（精确至0.0001 g），置于圆底烧瓶中，用85%乙醇回流2 h，过滤，于200 mL容量瓶中定容至刻度，于4℃冰箱中储存、备用。

将供试品溶液转移至离心管中，5000 r/min离心5 min，吸取5.0 mL上清液经0.22 μm滤膜过滤，制成样品等待分析。

2.3 液相色谱-质谱联用条件

色谱条件：色谱柱为Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A（2.00 mm×50 mm，4 μm）；流动相为水（0.1‰甲酸，A相）-甲醇（0.1‰甲酸，B相）；柱温40℃，流速为0.35 mL/min，进样体积5.0 μL梯度洗脱：0～1 min为0% B，1～1.01 min B相从0%迅速增加到30%，1.01～10 min B相從30%缓缓增加到100%，10～10.01 min从100%回到0%，10.01～15 min维持在0% B进行平衡。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）正离子模式（+），喷雾电压5.5 kV，喷雾温度550℃，帘气为25psi，GAS1为40psi、GAS2为60psi，CAD为6；多反应检测扫描（MRM）模式对小檗碱、千金藤素进行扫描，每个离子对的扫描时间为10 ms。小檗碱和千金藤素检测离子对分别为337.10→321.10和607.3→365.1。两种生物碱的质谱检测参数见表1。

2.4 线性关系考察

准确移取小檗碱（1.0 μg/mL）、千金藤素（1.0 μg/mL）的对照品溶液并依次配成5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 ng/mL对照品溶液，分别注入液-质色谱仪，记录峰面积。分别以质量浓度（ng/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，小檗碱回归方程为：Y=6.91×103X+1.27×104（r=0.9993），千金藤素回归方程为：Y=5.96×102X+3.6×103（r=0.9898）。结果表明小檗碱和千金藤素均在5.0～1000.0 ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 方法学考察

2.5.1 重复性试验准确称取兴隆采摘的粪箕笃粉末2.0 g，按“2.2”项下方法提取，制成样品溶液。按“2.3”项下的色谱条件，进样5 μL，测定，连续进样6次，测得峰面积。小檗碱的RSD为1.90%，千金藤的RSD为2.61%。表明重复性良好。

2.5.2 稳定性试验把制好的样品溶液及100.0 ng/mL的对照品溶液置于4℃冰箱中储存，分别于0、4、8、12、16、24 h后，按“2.3”项下色谱条件，进样5 μL，测定。对照品小檗碱、千金藤素的RSD分别为2.25%、2.32%，样品溶液小檗碱、千金藤素的RSD分别为2.12%、1.89%。结果表明，与0 h相比较，24 h后峰面积基本保持不变。结果表明对照品及供试品溶液稳定性良好。

2.5.3 精密度和回收率采用空白样品加标的方法进行添加回收率和精密度试验，在空白样品中添加低、中、高3个水平的标样后（10.0、100.0、500.0 ng/mL），每个添加量平行测定6次，计算回收率及标准偏差。结果表明小檗碱的平均回收率为101.46%～104.76%，RSD为2.14%；千金藤素的平均回收率95.96%～104.39%，RSD为4.63%，结果表明该方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。小檗碱和千金藤素对照品质谱图如图1所示：其中纵坐标表示响应强度（cps），横坐标表示保留时间（min）。从图1可知，小檗碱对照品和千金藤素对照品分别在3.22、3.01 min处出峰。

2.6 实际样品的测定

文昌和兴隆两地采摘的粪箕笃根茎经阴干、粉碎成40目细粉。分别精确称取2.0 g粉末经回流、过滤后按“2.2”项下方法处理成样品，定容至100 mL，经紫外分光光度法测得其总生物碱含量平均为0.40%[10]。样品经质谱分析如图1所示：文昌和兴隆粪箕笃中小檗碱、千金藤素分别在3.21、3.19；2.98、2.99 min处出峰，峰形尖锐。测得文昌、兴隆两地小檗碱含量分别为0.889、1.07 μg/g，千金藤素含量分别为7.62、38.0 μg/g，分别占总碱含量的0.022%、0.027%和0.19%、0.95%。

3 讨论

由于提取方式的不同，所得总生物碱也有所不同；同一药材不同产地的各种生物碱的种类及含量亦有一定的差异[19-20]。实验结果表明，海南两地粪箕笃中小檗碱和千金藤素含量有明显差异，千金藤素含量远高于小檗碱，但小檗碱地区间含量差异不是十分明显。本方法采用梯度洗脱，分别考察了水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇（1‰甲酸）及水-乙腈（1‰甲酸）作为流动相，发现在不含酸的体系中小檗碱、千金藤素有拖尾现象；而水-乙腈（1‰甲酸）作为流动相，基线不是很稳定，分离效果不如水-甲醇（1‰甲酸）效果好。因此，本研究采用水-甲醇（1‰甲酸）为流动相。使用的UFLC液相色谱仪配Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A型色谱柱，与文献[15-16]报道HPLC比较，具有用时少、出峰快速、灵敏度好等优点。本研究仅对海南当地药材进行上述相关考察，其他不同地区及植物不同部位的质量考察还有待进一步研究。

总之，本试验建立的HPLC-MS/MS方法具有分析速率快、灵敏度高、专属性强等优点，可用于粪箕笃及千金藤属植物中生物碱的定量分析。

[参考文献]

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