光核桃仁油对实验鼠与兔的急性毒性实验

2017-09-04孙位军周熙王张张静甘大莉梁源范刚尹鸿翔

中国医药导报 2017年21期

孙位军++++++周熙++++++王张++++++张静++++++甘大莉++++++梁源++++++范刚++++++尹鸿翔

[摘要] 目的研究光核桃仁油对小鼠、大鼠和兔的急性毒性。方法 KM种小鼠40只，雌雄各半，分为空白对照组和光核桃仁油组各20只，在24 h内分别连续灌胃3次生理盐水和光核桃仁油，最大给予剂量为289.224 g生药/（kg·d）。SD大鼠40只，雌雄各半，分为空白对照组和光核桃仁油组各20只，在24 h内分别连续灌胃3次生理盐水和光核桃仁油，最大给予剂量为144.612 g生药/（kg·d）。新西兰兔16只，雌雄各半，分为空白对照组和光核桃仁油组各8只，在24 h内分别连续涂抹皮肤3次生理盐水和光核桃仁油，最大给予剂量为482.28 mg生药/（cm2·d）。分别观察动物在14 d内所产生的毒性反应（死亡、中毒症状）及其严重程度、恢复情况、延迟反应等。结果未见动物死亡、中毒症状和肉眼可见的脏器异常。与空白对照组比较，大鼠和小鼠在灌胃1～3 d后出现大便溏稀，毛发油渍，但4 d后恢复正常。与空白对照组比较，在给药第7天雄性小鼠体重明显增高（P < 0.01），而雄性大鼠体重明显降低（P < 0.01）；兔皮肤涂抹光核桃仁油第2天，雌兔体重明显下降（P < 0.05）。与空白对照组比较，光核桃仁油组在给药后第1天小鼠饲料消耗量降低（P < 0.01）。与空白对照组比较，小鼠平均血红蛋白浓度出现异常（P < 0.05），但血液生化指标无明显变化；大鼠部分血常规指标[红细胞宽度变异系数、血小板数和血小板比积（P < 0.05）以及中间细胞百分比（P < 0.01）]和血液生化指标[白蛋白、总蛋白、球蛋白、胆固醇、尿素氮、总红胆素和三酰甘油（P < 0.05）以及肌酐（P < 0.01）]出现异常；兔部分血常规指标[血小板数、粒细胞绝对值、血小板比积、中间细胞百分比、血小板分布宽度、淋巴细胞百分比和粒细胞百分比（P < 0.05）]和血液生化指标[谷草转氨酶和肌酐（P < 0.05）]出现异常。结论大鼠和小鼠经口给予光核桃仁油的最大给药量分别为144.612 g生藥/（kg·d）和289.224 g生药/（kg·d），兔经皮肤给予光核桃仁油的最大给药量为482.28 mg生药/（cm2·d），安全性良好，但在临床应用时应监测血常规和血液生化学指标。

[关键词] 光核桃仁油；最大给药量；急性毒性；大鼠；小鼠；兔

[中图分类号] R28 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0018-07

[Abstract] Objective To study the acute toxicity of Prunus mira oil used in mice， rats and rabbits. Methods 40 KM mice which were half male and half female were divided into blank control group and Prumus mira oil group， each group had 20 mice. Within 24 hours， the mice were given normal saline and Prumus mira oil with one maximum dosage amounting to 289.224 g dried medicinal herbs/（kg·d） in a total of 3 times through mouth. 40 SD rats which were half male and half female were divided into blank control group and Prumus mira oil group， each group had 20 mice. Within 24 hours， the rats were also given normal saline and Prumus mira oil with one maximum dosage of 144.612 g dried medicinal herbs/（kg·d） in a total of 3 times in the same way. 16 New Zealand rabbits which were half male and half female were divided into blank control group and Prumus mira oil group， each group had 8 rabbits. Within 24 hours， the rabbits were given normal saline and Prumus mira oil with one maximum amount of 482.28 mg dried medicinal herbs/（cm2·d） 3 times through skin. And the toxic effects （death， poisoning symptoms） and the severity and recovery， as well as delayed reaction shown on these three animals were carefully observed within 14 days. Results There was no death， poisoning symptoms and organ abnormality visible to the naked eye. Compared with the blank control group， the mice and rats produce loose stool and oily hair after being given medicine within 1-3 d， but return to normal in 4 d. Compared with the blank control group， weights were significantly increased in the male mice （P < 0.01）， but significantly decreased in the male rats （P < 0.01） after taking Prunus mira oil of 7 d （P < 0.01）， and the weights of female rabbits decreased significantly after taking Prunus mira oil of 2 d through skin （P < 0.05）. Compared with the blank control group， the feed consumption of mice in the Prumus mira oil group were decreased after 1 d medication （P < 0.01）. Compared with the blank control group， the average hemoglobin concentration of mice in the Prumus mira oil group were abnormal （P < 0.05）， but their blood biochemical indexes showed no obvious change. Some blood indexes [RDW-CV， PLT， PCT （P < 0.05） as well as Mid% （P < 0.01）] and blood biochemical indexes [ALB， TP， GLO， CHOL， BUN， T-Bil and TG （P < 0.05） as well as CREA （P < 0.01）] showed abnormalities in rats of the Prumus mira oil group. Certain blood indexes [PLT， GR#， PCT， Mid%， PDW， LY% and GR% （P < 0.05）] and blood biochemical indexes [AST and CREA （P < 0.05）] showed abnormalities in rabbits of the Prumus mira oil group. Conclusion Maximum dosage given to the mice and rats through mouth are respectively 289.224 g dried medicinal herbs/（kg·d） and 144.612 g dried medicinal herbs/（kg·d）， while the maximum dosage given to the rabbits through skin is 482.28 mg dried medicinal herbs/（cm2·d）. There is no security problem， but the blood routine and blood biochemistry indexes should be monitored during clinical application.

[Key words] Prunus mira oil； Maximum dose； Acute toxicity； Rat； Mice； Rabbit

光核桃（Prunus mira Koehne），又名康布、毛桃、藏桃，分布于西藏、四川和云南等地[1]且潜藏巨大的经济价值[2]。光核桃仁曾被《四川省中药材标准》收载，有活血祛瘀、润肠通便功效[3]，藏医《晶珠本草》[4]和《藏药志》[5]记载：种子榨取油涂擦治黄水病，头发、眉毛、胡子等脱落症。光核桃仁中不饱和脂肪酸的含量极高[6-8]。光核桃仁水煎液有抗炎作用，小鼠LD50为（42.81±0.02）g/kg，为临床常用量（0.18 g/kg）的238倍；大鼠长毒试验结果未见异常[9]。但是光核桃仁油的急性毒性未见报道。遵照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》[10]，本研究开展光核桃仁油的急性毒性研究，旨在为后续光核桃仁油的长期毒性和药理研究提供安全剂量参考值。

1 材料与方法

1.1 试验药物

光核桃的干燥种子，采集于四川省甘孜州得荣县，由成都中医药大学贾敏如教授鉴定为蔷薇科光核桃（Prunus mira Koehne）。

1.2 實验动物

KM小鼠和SD大鼠，雌雄各半，均为40只，4周龄小鼠体重为18～22 g，6～8周龄大鼠体重为180～220 g，均为封闭群、SPF级，小鼠和大鼠的实验动物质量合格证号分别为51203500000978和512035000 00945，均由成都达硕生物科技有限公司提供。新西兰兔，雌雄各半，16只，体重为1.8～2.0 kg，8～10周龄，封闭群，普通级，由四川省实验动物专委会养殖场提供，实验动物质量合格证号：0015884。动物实验设施由成都中医药大学提供，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2014-124。

1.3 试剂

测试血常规和血液生化指标的试剂盒，均来自上海特康科技有限公司，见表1。

1.4 仪器

全自动三分群血液分析仪（型号TEK-Ⅱ MINI）和全自动生化分析仪（型号TC6010L）均由上海特康科技有限公司生产。

1.5 实验方法

1.5.1 光核桃仁油榨取用德力生榨油机榨取（40℃）光核桃仁油，经滤网粗过滤后为橙黄半透明油状液体，低温保存，即为最大浓度的光核桃仁油供试品（2.4102 g药材/mL）。

1.5.2 急性毒性试验参考文献[11-14]和预实验，以最大给药量法开展急性毒性实验。取小鼠和大鼠各40只，按体重分层后再按随机数字表法分为空白对照组和光核桃仁油组，每组各20只，雌雄各半，给药前禁食不禁水12 h。空白对照组灌胃生理盐水，光核桃仁油组灌胃光核桃仁油，大鼠和小鼠给药体积分别为20 mL/kg和40 mL/kg，间隔4～6 h，连续灌胃3次。观察14 d，记录中毒症状、死亡情况、体重变化及进食情况。第14天将动物麻醉（ip，水合氯醛），大鼠经腹主动脉取血5 mL，分置两管，其中一管做抗凝处理，用于测试血常规指标；另一管自然凝固后分离出血清，用于测试血液生化学指标。20只小鼠，两组各10只（雌雄各半），眼球采血做抗凝处理；其余20只小鼠，两组各10只（雌雄各半），分离血清。

取兔16只，雌雄各半，按体重分层后再按随机数字表法分为空白对照组和光核桃仁油组，每组各8只，雌雄各4只，剃毛约为15 cm×10 cm[15-16]。空白对照组涂抹生理盐水，光核桃仁油组涂抹光核桃仁油，给药体积为每次666.67 mL/m2，连续涂抹3次，间隔至少6～7 h。观察和测试指标同大鼠。

1.6 统计学方法

运用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况和尸检结果

灌胃光核桃仁油30 min内，鼠均出现精神萎靡、行动迟缓，随后迅速恢复正常，观察期内无动物死亡。第1～3天大便溏稀，毛发油渍，但第4天后恢复正常。第14天解剖所有动物，内部脏器[17]未见肉眼可见异常。

首次涂抹光核桃仁油后，兔无死亡和中毒反应，外观体征无异常，皮肤无刺激性表现。第14天解剖所有兔，内部脏器未见肉眼可见异常。

2.2 体重及饲料消耗量

2.2.1 小鼠由表2可见，与空白对照组同性别动物比较，小鼠服用光核桃仁油7 d后，雄性小鼠体重明显增加。由表3可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组在给药后第1天小鼠饲料消耗量降低（P < 0.01），但在第7天后，小鼠饲料消耗量又逐渐增高。

2.2.2 大鼠由表4可见，与空白对照组同性别动物比较，雌性大鼠服用光核桃仁油1 d后，雌性大鼠体重增加，雄性大鼠体重降低（P < 0.01）；在给药后第7天雄性大鼠体重明显降低（P < 0.01）。由表5可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组大鼠饲料消耗量无明显变化（P > 0.05）。

2.2.3 兔由表6可见，与空白对照组同性别动物比较，雌兔皮肤涂抹光核桃仁油第2天体重明显下降（P < 0.05）；而雄兔体重无明显变化。由表7可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组兔的饲料消耗无明显变化（P > 0.05）。

2.3 血常规

2.3.1 小鼠由表8可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组雌雄小鼠的平均血红蛋白浓度均增加（P < 0.05），其他指标均无明显变化（P > 0.05）。

2.3.2 大鼠由表9可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组雄性大鼠的红细胞宽度变异系数减少（P < 0.05），中间细胞百分比明显减少（P < 0.01）；雌性大鼠的血小板数和血小板比积含量增加（P < 0.05）；其他指标均无明显变化（P > 0.05）。

2.3.3 兔由表10可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组雌兔的血小板数、粒细胞绝对值和血小板比积均增加（P < 0.05），中间细胞百分比和血小板分布宽度减少（P < 0.05）；雄兔的淋巴细胞百分比减少（P < 0.05），粒细胞百分比增加（P < 0.05）；其他指标均无明显变化（P > 0.05）。

2.4 血液生化指标

2.4.1 小鼠由表11可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组小鼠的血液生化指标均无明显变化（P > 0.05）。

2.4.2 大鼠由表12可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组雄性大鼠的白蛋白含量增加（P < 0.05）；雌性大鼠的总蛋白、白蛋白、球蛋白、胆固醇、尿素氮和肌酐的含量减少（P < 0.05或P < 0.01），但总胆红素和三酰甘油的含量增加（P < 0.05）；其他指标均无明显变化（P > 0.05）。

2.4.3 兔由表13可见，与空白对照组比较，光核桃仁油组雌兔的谷草转氨酶活性增强（P < 0.05），肌酐减少（P < 0.05），其他指标均无明显变化（P > 0.05）。

3 讨论

大鼠灌胃给予光核桃仁油的最大剂量为144.612 g生药/（kg·d），小鼠为289.224 g生药/（kg·d）。光核桃仁油的成人日用剂量为5 g[18]，即5 g/60 kg，故上述给药剂量分别为成人日用剂量的1735.344倍和3470.688倍。兔皮肤给予的最大剂量为482.28 mg/（cm2·d）。

光核桃仁毒性主要是苦杏仁苷在体内分解出较多的氢氰酸[19]。苦杏仁苷的另一个水解产物为苯甲醛[20]，具有良好的抑菌和抗癌作用，也作食品添加剂使用[10]，可降低光核桃仁油的毒性。本文发现光核桃仁油对实验鼠与兔的毒性较低，推测可能与光核桃仁油中氢氰酸和苯甲醛的比例有一定的关系，有待进一步研究。

[参考文献]

[1] 曾秀丽，谭江平，王玉霞，等.西藏光核桃研究进展[C]//中国园艺学会桃分会第三届学术研讨会，2011.

[2] 张丽荣，孟锐，路国彬，等.光核桃遗传资源的经济价值评估与保护[J].生态学报，2013，33（22）：7277-7287.

[3] 四川省卫生厅.四川中药材标准（增补本）[M].成都：成都科技大学出版社，1991：76.

[4] 帝玛尔.丹增彭措.晶珠本草[M].上海：上海科学技术出版社，1986：67.

[5] 中国科学院西北高原生物研究所.藏药志 [M].西宁：青海人民出版社，1991：20-22.

[6] 魏丽萍，钟政昌，李明.光核桃仁脂肪油的提取与其理化性质分析[J].经济林研究，2013，31（3）：136-139.

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[8] 张庆华，孟绍江，王静萍，等.西藏六种植物种子油的成份分析[J].植物学报，1979，21（1）：80-81.

[9] 刘灿辉，季伯友，谢玉琼.光核桃仁和山桃仁的药理研究[J].中药药理与临床，1989，5（2）：46-47.

[10] 国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则（2005年）[S].北京：中国医药科技出版社，2006.