信号转导及转录激活因子3在紫铆因诱导人肺腺癌A549细胞凋亡作用的研究

陈少阳++++++岳宏林++++++刘旭

[摘要] 目的 探討紫铆因（BTN）诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用及信号转导及转录激活因子3（STAT3）在该过程发挥的作用。 方法 常规培养A549细胞，给予0、25、50 μmol/L的BTN处理24 h，BTN 0 μmol/L为对照组，检测各组细胞活力、凋亡、迁移、ROS含量及Caspase-3活性，STAT3通路（p-STAT3、STAT3）和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）含量变化。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）5 mmol/L特异性抑制活性氧（ROS）生成后，BTN（0、50 μmol/L）处理细胞24 h，重复上述检测。建立裸鼠皮下肿瘤模型，腹腔注射BTN（2、4 mg/kg），对照组注射等体积PBS，明确BTN抗肺腺癌的作用。 结果 与对照组相比，BTN（25、50 μmol/L）有效抑制A549细胞活力和迁移（P < 0.05），促进凋亡（P < 0.05），显著增加ROS含量及Caspase-3活性（P < 0.05）。Western blot结果显示，相比对照组，BTN处理抑制p-STAT3和Bcl-2表达（P < 0.05），上调凋亡蛋白Bax表达（P < 0.05）。相比BTN组，应用NAC后则抑制BTN促ROS生成（P < 0.05），同时拮抗了BTN抑制STAT3磷酸化和促凋亡作用（P < 0.05）。在体研究发现，相比对照组，BTN处理剂量依赖地抑制肿瘤生长，抑制STAT3磷酸化（P < 0.05）。结论 BTN可有效抑制肺腺癌A549细胞活力、促进细胞凋亡，此作用可能与促ROS生成进而抑制STAT3磷酸化有关。

[关键词] 紫铆因；肺腺癌；信号转导及转录激活因子3；活性氧；凋亡

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0029-05

[Abstract] Objective To investigate the pro-apoptotic effect of Butein （BTN） in lung adenocarcinoma A549 cells and the role of STAT3 signaling in this process. Methods A549 cells were cultured and treated with different concentrations of BTN （0， 25， 50 μmol/L） for 24 h. BTN 0 μmol/L was taken as the control group. The survival rate， apoptotic rate， cell migration， ROS generation， Caspase-3 activity were respectively detected after treatment. Western blot was used to detect expression of p-STAT3， STAT3， Bcl-2 and Bax. NAC 5 mmol/L was used to block the generation of ROS， then BTN treatment （0， 50 μmol/L） was implemented for further detection as mentioned. Besides， in vivo studies were also used to verify whether abdominal injection with BTN （2， 4 mg/kg） exerted anticancer activity， while the control group was injected with PBS. Results Compared with the control group， BTN （25， 50 μmol/L） treatment resulted in reduction of cell viability and migration （P < 0.05）， promotion of cell apoptosis （P < 0.05）， up-regulation of ROS and Caspase-3 levels （P < 0.05）. BTN treatment resulted in a significant down-regulation of p-STAT3 and Bcl-2， and up-regulation of Bax （P < 0.05）. Moreover， inhibition of ROS by NAC antagonized the anti-STAT3 phosphorylated and pro-apoptotic role of BTN on A549 cells （P < 0.05）. In vivo studies showed that compared the control group， tumor volume and p-STAT3 expression in nude mice were significantly reduced after BTN treatment （P < 0.05）. Conclusion BTN treatment effectively inhibits cell viability and promotes apoptosis in A549 cells， which may be related to the up-regulation of ROS level thus inhibiting STAT3 phosphorylation.

[Key words] Butein； Lung adenocarcinoma； STAT3； ROS； Apoptosis

紫铆因（Butein，BTN）大量存在于漆树等植物中[1]，具有显著的抗肿瘤作用[1-5]。信号转导及转录激活因子3（STAT3）在多种肿瘤中呈现持续的激活（磷酸化）状态[6-7]，上调活性氧（ROS）含量则抑制STAT3激活进而促进肿瘤细胞凋亡[2，8-9]。关于BTN在肺腺癌中的作用尚未明确，本研究通过BTN作用于肺腺癌A549细胞系，观察细胞活力、凋亡率、迁移能力及STAT3通路的变化，结合裸鼠种植瘤模型研究STAT3通路在BTN诱导A549细胞凋亡过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料

A549细胞系购自中科院上海细胞研究所。紫铆因，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），二甲基亚砜（DMSO），噻唑蓝（MTT），2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），DAPI购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；Bcl-2，Bax和β-actin抗体购自美国Abcam公司；STAT3，p-STAT3（Tyr705）购自美国CST公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；TUNEL检测试剂盒购自德国Roche公司；ROS检测试剂盒及Caspase-GloR3/7定量试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 BTN及NAC母液配制

BTN先以DMSO溶解为100 mmol/L母液，滤菌后4℃保存备用。NAC以去离子水稀释为500 mmol/L母液，分装滤菌后-20℃保存备用。BTN浓度和处理时间参考其他肿瘤中BTN相关研究及前期预实验结果，BTN 50 μmol/L处理24 h对A549细胞具有显著的杀伤作用[4]。

1.3 細胞培养

A549细胞用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL链霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培养基培养于37℃、5% CO2湿化孵箱中。细胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，根据实验需要把细胞接种于不同的培养板中。细胞学实验为两部分，用无血清DMEM高糖培养基将BTN和NAC稀释到目的浓度后，第一部分分组为对照组（0.1% DMSO）及25、50 μmol/L BTN分别处理的实验组；第二部分分组为对照组（0.1% DMSO），NAC 5 mmol/L，BTN 50 μmol/L以及NAC 5 mmol/L+BTN 50 μmol/L共处理的实验组，无血清DMEM高糖培养基培养24 h后分别进行下述实验检测。

1.4 MTT法检测细胞活力

每孔7×103个细胞接种于96孔板，设6个复孔，经处理后洗涤3次。加入MTT试剂，37℃孵育4 h，弃去培养液，加入DMSO原液，振荡使结晶完全溶解，酶标仪测定吸光度值（490 nm）。细胞活力=各实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡率

制作细胞爬片，于4℃用4%的多聚甲醛固定10 min。PBS洗涤3次，0.1%的Triton X-100打孔10 min，PBS洗涤1次。严格按照TUNEL法试剂盒的说明进行操作。在共聚焦显微镜下观察，其中凋亡细胞TUNEL染色后为绿色荧光，细胞核DAPI染色后为蓝色荧光，随意选取10个视野计数，计算凋亡率=视野内凋亡细胞数/视野内总细胞数×100%。

1.6 划痕实验

细胞接种到6孔板，贴壁后在板底部划三条横线，用200 μL枪头在每孔中划一条纵线，PBS洗后于培养基中培养24 h后测量划痕宽度。

1.7 Caspase-3活性测定

以每孔4×106个细胞接种于6孔板，细胞处理结束后，收集并裂解提取细胞蛋白。之后每孔加入100 μL Caspase-GloR3/7工作液，室温下避光孵育1 h，酶标仪检测荧光强度（波长405 nm）。Caspase-3活性=各实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.8 ROS含量测定

根据实验分组处理后将细胞消化并悬浮于稀释的DCFH-DA中，CO2培养箱孵育细胞2 h，用酶标仪检测其荧光强度（激发光波长设为485 nm，发射光波长设为530 nm）。ROS含量=各实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.9 裸鼠皮下肿瘤接种及测量

裸鼠购自斯莱克景达实验动物有限公司（动物质量合格证号No.43004700032628）。将裸鼠按体重编号，按随机区组法分为对照组、2 mg/kg BTN组、4 mg/kg BTN组，每组6只。取对数期A549细胞，裸鼠肩部皮下注射接种9×106个细胞。接种后饲养于SPF环境。每天分别给予腹腔注射PBS、2 mg/kg BTN、4 mg/kg BTN处理，每隔3天测量裸鼠体重和肿瘤体积。第28天处死小鼠并取皮下肿瘤，通过Western blot检测瘤体p-STAT3水平。

1.10 Western blot检测

细胞或瘤体匀浆在裂解缓冲液中裂解，以12 000 r/min离心15 min。收集上清液，蛋白定量，高温变性后，蛋白行SDS-聚丙烯凝胶电泳并转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜。洗膜后二抗孵育2 h，洗涤3次，电化学发光试剂显影，并用软件分析蛋白的相对表达量（Bio-Rad，West Berkeley，California，USA）。结果以各组目的条带灰度值与内参作比后，再以对照组为100%进行标准化。

1.11 统计学方法

以SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活性检测结果

不同浓度BTN处理A549细胞24 h后，可见BTN使细胞变圆、收缩甚至脱落。相对于对照组，不同浓度BTN处理后细胞活力分别下降到（72.4±5.6）%、（54.2±7.1）%，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 细胞凋亡率检测结果

与对照组相比，不同浓度BTN（24 h）可以有效诱导细胞凋亡[对照组：（2.1±2.44）%，BTN 25 μmol/L：（25.4±6.10）%，BTN 50 μmol/L：（50.3±6.40）%]，且呈浓度依赖性（P < 0.05）。见图2。

2.3 细胞迁移能力的影响

梯度浓度处理A549细胞24 h，细胞间距分别扩大到对照组的（1.46±0.13）、（1.85±0.23）倍，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 ROS含量及Caspase-3活性测定结果

与对照组相比，不同浓度BTN可以使A549细胞ROS含量增加[（185.6±21.8）%、（289.2±26.5）%]，Caspase-3活性升高[（194.3±24.1）%、（295.6±25.1）%]，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

2.5 Western blot检测结果

不同浓度BTN处理A549细胞24 h后，Western blot检测STAT3和凋亡相关蛋白表达的变化结果显示，与对照组比较，BTN处理组细胞Bax表达上升，p-STAT3和Bcl-2的表达下降，且BTN浓度越高变化越明显（P < 0.05）；但STAT3表达无明显改变（P > 0.05）。见图5。

2.6 应用NAC抑制A549细胞ROS生成后各项检测结果

2.6.1 細胞活力及ROS含量测定结果 不同组（对照组、NAC 5 mmol/L、BTN 50 μmol/L、NAC 5 mmol/L+BTN 50 μmol/L）处理A549细胞24 h后，与对照组相比，NAC 5 mmol/L组处理对ROS含量和细胞活力无影响（P > 0.05）；与BTN 50 μmol/L组相比，BTN 50 μmol/L+NAC 5 mmol/L组ROS含量显著降低，细胞活力显著提高（P < 0.05）。表明NAC有效抑制ROS生成后，BTN抑制细胞活力的能力显著降低。见图6。

2.6.2 Western blot检测结果 与对照组相比，NAC 5 mmol/L组p-STAT3表达明显减少（P < 0.05），STAT3、Bax和Bcl-2表达无明显变化（P > 0.05）。与BTN 50 μmol/L组相比，BTN 50 μmol/L+NAC 5 mmol/L组Bax表达明显减少，p-STAT3、Bcl-2表达显著提高，差异有统计学意义（P < 0.05），而STAT3表达差异无统计学意义（P > 0.05）。表明抑制ROS生成能够拮抗BTN抑制STAT3磷酸化和促凋亡作用。见图7。

2.7 腹腔注射BTN对裸鼠在体肿瘤及Western blot检测瘤体p-STAT3含量影响

同批次裸鼠肩部皮下注射对数期A549细胞9×106个/只，待瘤体体积达到100 mm3时开始每日腹腔注射PBS、2 mg/kg BTN、4 mg/kg BTN，每3天测量记录体重和肿瘤体积，发现BTN处理对裸鼠体重无影响（P > 0.05），但剂量依赖地抑制肿瘤生长（P < 0.05），28 d时，三组肿瘤体积分别为（861±63）、（495±53）、（362±49）mm3，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图8。Western blot检测发现，与对照组比较，BTN处理组瘤体p-STAT3表达明显下调，呈浓度依赖性（P < 0.05），但对STAT3表达无明显变化（P > 0.05）。见图9。

3 讨论

肺腺癌的治疗手段主要是手术和放化疗，但是其远期效果并不理想[10-14]，探索新型抗肿瘤药物如紫铆因等成为临床和基础研究热点[15]。BTN有显著抗肿瘤作用[1-5]，其机制与抑制肿瘤细胞周期、促进凋亡、抗肿瘤侵袭和转移、诱导氧化应激反应等有关[1，3-5，16]。本研究证实BTN具有显著的抗肺癌作用，有效抑制A549细胞的活力和迁移能力，促进细胞凋亡，提高Caspase-3活性和ROS含量，并提示BTN诱导的A549细胞凋亡与激活氧化应激损伤有关。

STAT3在多肿瘤中呈现持续的激活（磷酸化）状态[6-7]，STAT3持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，并且与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移关系密切[17-20]。本研究首次发现，BTN作用于A549细胞可显著上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调p-STAT3和Bcl-2的表达。上述结果说明BTN可抑制STAT3激活发挥抗肺腺癌作用，此结果同样在A549细胞裸鼠种植瘤模型中的到验证。

过往研究表明，上调ROS含量抑制STAT3激活进而促进肿瘤细胞凋亡[2，8-9，17]。本项研究应用NAC抑制A549细胞ROS生成后，可显著拮抗BTN抑制A549细胞STAT3磷酸化和促凋亡作用。本研究首次证实BTN抑制A549细胞STAT3激活与上调ROS生成有关，进一步拓展了BTN作为新型抗肺癌天然药物的作用机制。然而，BTN上调ROS含量后如何抑制STAT3磷酸化的具体作用机制尚未完全明确，以及BTN是否有潜在的毒副作用仍需深入研究。

[参考文献]

[1] 张丽瑞，陈葳，李琛，等.紫铆因抑制膀胱癌细胞增殖的体内外研究[J].肿瘤防治研究，2014，41（7）：714-718.

[2] Rajendran P，Ong TH，Chen L，et al. Suppression of signal transducer and activator of transcription 3 activation by butein inhibits growth of human hepatocellular carcinoma in vivo [J]. Clin Cancer Res，2011，17（6）：1425-1439.

[3] 李伟，刘文斌，刘海丹.紫铆因靶向EGFR和AuroraA/B信号通路抑制非小细胞肺癌的研究[J].生命科学研究，2016，20（5）：418-423.

[4] 李伟，刘文斌，刘海丹.紫铆因对食管鳞癌细胞增殖和存活影响的初步研究[J].激光生物学报，2016，25（2）：123-128.

[5] 张琼，梁宗文，胡越，等.紫铆因改善化疗损伤卵巢功能的研究[J].中国现代医生，2016，54（34）：35-39.

[6] 王竞，姜斌.STAT3与恶性肿瘤耐药的研究进展[J].医学综述，2012，18（12）：1845-1847.

[7] 周唯，许言午，潘一滨.STAT3与肿瘤自噬[J].生命的化学，2016，36（1）：66-70.

[8] 高安定，林宝顺，兰小鹏.STAT3与肿瘤[J].中国生物化学与分子生物学报，2013，29（5）：397-403.

[9] 李玉倩，蔡天池，朱月春.肿瘤细胞中ROS与STAT3/5的相互调控[J].生命的化学，2016，36（3）：379-384.

[10] 高亭，谢军平，段凤英.抑制血管生成在肺癌治疗中的研究进展[J].广东医学，2012，33（15）：2353-2355.

[11] 陈秀勇.肺癌治疗的进展[J].浙江肿瘤通讯，1978（2）：65-68.

[12] 王彩霞，烏兰，郑源强，等.纳米药物在肺癌治疗中的研究进展[J].医学综述，2017，23（2）：311-317.

[13] 姜格宁.多病灶肺癌的外科诊治[J].外科研究与新技术，2013（3）：149-151.

[14] 任华.外科手术在肺癌治疗中的地位[J].武警医学，2011， 22（11）：921-924.

[15] Padmavathi G，Rathnakaram SR，Monisha J，et al. Potential of butein，a tetrahydroxychalcone to obliterate cancer [J]. Phytomedicine，2015，22（13）：1163-1171.

[16] 黎巧茹，赖文英，林春燕，等.紫铆因抗急性淋巴细胞白血病细胞的体外作用及机制研究[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2017，22（2）：61-65.

[17] 庞姗姗，朱悦，周逸婵，等.熊果酸通过ROS/AMPK/STAT3信号通路抑制胃癌细胞COX-2表达[J].江苏医药，2015，41（12）：1368-1370.

[18] 韩春生，陈艳，伍学强.STAT3在肿瘤形成中的作用[J]. 中国实验血液学杂志，2013，21（2）：517-520.

[19] 杨华静，吴晓梅，万小平.STAT3在妇科肿瘤中的研究进展[J].肿瘤，2010，30（11）：985-988.

[20] 柏素云，王蔚林，李冠武，等.EGFR-STAT3信号转导通路与肿瘤[J].肿瘤防治杂志，2004，11（9）：989-991.