食源性糖蛋白富集及其应用的研究进展

于志鹏，郭辉，赵文竹，*，陈月皎，丁龙，刘静波，励建荣，*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.吉林大学营养与功能食品研究室，吉林长春130062）

食源性糖蛋白富集及其应用的研究进展

于志鹏1，郭辉1，赵文竹1，*，陈月皎1，丁龙2，刘静波2，励建荣1，*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.吉林大学营养与功能食品研究室，吉林长春130062）

糖蛋白种类繁多，存在形式复杂多样，但糖蛋白含量较低，因此高选择性的分离纯化富集是食源性糖蛋白深入研究的基础。就食源性糖蛋白分离富集方法及其应用进展进行综述，旨在为糖蛋白或糖肽的富集的研究提供参考。

糖蛋白；分离；纯化；富集

糖蛋白对生长发育、信息传递、免疫调节等多种生命活动起着重要作用[1]。研究发现，糖蛋白具有调节免疫力[2-3]、抗氧化、防衰老、抗炎症、降低血糖和降血脂等生物活性功能[4-5]。随着糖生物学和现代分离纯化技术的发展，糖蛋白的提取、纯化、分离富集等研究已成为诸多科研人员关注的焦点。目前已证实多种海洋软体动物的糖蛋白具有明显的抑制肿瘤、抗癌等活性[6-7]，糖蛋白更多的生物活性逐渐被发现。糖蛋白是由长度较短、带分支的寡糖与多肽链共价连接而形成，其连接方式为N-连接的糖链、O-连接的糖链、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白及C-连接的糖链，其中以O型糖蛋白和N型糖蛋白最为常见。糖蛋白的结构及糖链的解析均需要较高纯度的糖蛋白，因此糖蛋白的分离纯化研究成为后续深入研究糖蛋白结构和功能的关键和基础，也成为当前糖蛋白研究关注的焦点。因此，本文对糖蛋白分离纯化方面的研究进行综述。

1 层析法

1.1 凝集素亲和技术

凝集素是一种对糖蛋白上的糖类具有高度特异性的结合蛋白，能够专一的识别某一种特殊结构的单糖或聚糖中的特定糖基序列并与之结合，并与糖链的结合是非共价且可逆的，糖蛋白或糖肽被凝集素捕获后，通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将糖蛋白或糖肽洗脱下来。时照梅等[8]制备了两种以氧化石墨烯（GO）为载体的新型固定化凝集素，利用GO比面积较大等特点，实现了高负载的凝聚素固定。Goncalves等[9]研究了4种不同材料的超大孔致冷剂凝集素纯化方法，其中一种将制冷的戊二醛改性的方法应用于伴刀豆球蛋白凝集素吸附过程中，它的吸附能力和稳定性都有不同的提升。Liu等[10]利用氧化葡聚糖促进合成的硅基材料伴刀豆球蛋白凝集素亲和富集糖蛋白/糖肽。“糖捕获法（glycol-catch）”的凝集素亲和技术逐渐用于糖蛋白/糖肽的分离富集，该方法已被成功地用于牛胎球蛋白、鸡卵清蛋白、转铁蛋白和人血清等复杂样品的处理[11]。李凤等[12]利用一种新型纳米材料与凝集素结合的方法富集人血清中特异性糖蛋白。凝集素技术相对成熟、操作简单、重复性好，但凝集素成本较高而且本身特异性的结合限制了富集样品的选择性，同时由于基质材料的比面积较小，导致凝集素负载量偏低，影响了富集效率。

凝集素亲和技术还可分为单种凝集素亲和法、多种凝集素亲和法、连续凝集素亲和法（SLAC法）、凝集素固定技术以及凝集素微柱和质谱联用。单种凝集素法只能富集样品中特定的糖蛋白/糖肽，多种凝集素法进一步提升了富集的效率，富集的蛋白质较为复杂时，使用连续凝集素法可以得到可信度更高的糖蛋白/糖肽，凝集素固定技术使凝集素固定在具有亲和性的多种材料上，从而提供了不同的富集途径和方法。凝集素微柱和质谱联用能够检测含量稀少、蛋白质动态范围大的一些低丰度糖蛋白，和LC-MS/MS在线联用，可进一步提高自动化程度。凝集素亲和技术是目前糖蛋白质组学中应用最广泛的分离富集方法。

1.2 硼酸亲和技术

硼酸亲和技术是利用硼酸基团可以和糖肽中的糖链上的顺式邻位或间位羟基发生可逆反应生成环状二脂，碱性条件下共价结合，酸性条件下分解的原理对糖蛋白/糖肽进行分离富集。硼酸亲和技术优点在于反应只需改变pH值且操作简便，通过优化富集分离可以将非特异性吸附作用力抑制或消除，该方法具有分子目标高专一性[13]，普适性强。近年来，利用硼酸类亲和材料对带有顺式二醇基团物质的富集方法迅速出现，例如磁性纳米颗粒[14]、中孔硅胶、琼脂糖、固相萃取材料等。

1.3 亲水相互作用色谱法

糖链因其多羟基结构具有较强的亲水性，所以很多亲水性的层析介质都可以用来分离富集糖蛋白/糖肽。优点在于操作简单，能非选择性的富集不同类型的糖肽。缺点主要有：该方法属于非特异性吸附，对糖蛋白/糖肽分离富集可能会存在相当大的非特异性吸附，未能彻底除去少量非糖基化蛋白，对后续研究的准确性有很大的影响[15]。

1.4 分子筛法富集糖肽

分子筛是一种包含有精确和单一的微小孔洞的材料，可用于吸附气体或液体，只有分子直径小于孔穴直径的物质才可能进入分子筛的晶穴内部，通过吸附的优先顺序和尺寸大小来区分不同物质的分子，所以被形象的称为“分子筛”。Alvarez-Manilla等[15]的研究发现，NCBI(美国国立生物技术信息中心）中人类蛋白酶经胰酶理论酶切后，有90%以上的肽段分子质量小于2 000 u，即使是最小的N型糖链的分子质量也要超过1 200 u，从二者的分子质量中可以看出，糖链对于糖基化肽分子质量是有较大影响的。他们利用分子筛的方法非选择性的对糖肽与非糖基化肽进行分离，得到了显著的效果。其优点在于该方法操作难度低，能非选择性的富集糖肽。缺点主要有：若酶切不完全，未完全酶切的高分子质量片段将会影响糖肽的富集。

1.5 抗体亲和层析

对于生物大分子的富集，抗体亲和层析法是一种较好的方法，它通过抗原抗体结合的稳定性和专一性来进行富集。这些抗体一般具有位点依赖性，且往往需要结合多个单糖才表现出较强的亲和力。目前最常用的两种O-GlcNAc抗体是RL2和CTD110.6[16]。抗体亲和法主要应用于O-GlcNAc糖基化的糖蛋白/糖肽的富集[17]，可以利用β-O-GlcNAc糖基化具有特异性的单克隆抗体进一步分析，高灵敏、精确的确定β-OGlcNAc的糖基化位点。Andre[18]等利用CD（免疫细胞表面的一种受体）9 partner-1（CD9P-1）的抗体从全蛋白中富集纯化出CD9P-1，通过质谱技术鉴定得到了CD9P-1的9个糖基化位点。它的优点在于特异性好、富集效率高，但目前相对应糖蛋白/糖肽的抗体较少，限制了它的使用。

1.6 强阳离子交换色谱法（Strongcationexchange，SCX）

自Beausoleil等[19]将SCX成功应用到磷酸化肽段的富集后，SCX已成为大规模磷酸化蛋白质组联合富集路线中最常用的一维分离技术。隋少卉等[20]研究表明SCX分离磷酸化肽段策略是基于磷酸化肽段与非磷酸化肽段在酸性溶液中所带电荷的不同达到分离目的。曹晶等[21]在糖蛋白/糖肽的分离富集的研究中发现，含有较少电荷的唾液酸残基的糖肽会较普通的糖肽先行流出，从而得到分离。在强阳离子交换色谱中，单电荷肽段比多电荷肽段流出时间早。

目前，针对复杂的生物样本，主要采用的是多维分离分析系统，如多维蛋白质鉴定技术，即采用强阳离子交换色谱和反相液相色谱两种分离原理正交的分离方法构成多维分离，结合串联质谱组成的一种多维分离鉴定技术。

1.7 对角线色谱法

对角线色谱法是将两个相同的、连续的肽在酶或化学选择肽的侧链结构之间的改变来进行分离的，这种选择和改变的肽能得到不同的色谱性能，从而可以分离肽列中未发生改变的肽段。

Gevaert等[22]将组合分离对角色谱（COFRADIC）应用在N型糖基化肽段的分离上，通过两次相同条件的反向液相色谱来分离某些特定的肽段。他们通过比较使用唾液酸苷酶在相同的条件下得到的相对应色谱中峰的移动鉴定了血清中93个唾液酸的糖基化位点及相应的53个糖蛋白。

2 化学修饰法

糖蛋白/糖肽化学修饰是通过特异性地修饰糖蛋白/糖肽上的糖链而使糖基化蛋白/多肽被选择性的分离富集，从而实现降低待研究样品的复杂程度。

2.1 肼化学富集法

肼化学法是利用糖蛋白/糖肽上的邻二醇结构来进行富集，其方法包括以下几个步骤：①氧化，利用高碘酸盐将糖链上的顺式邻二醇氧化成醛；②偶联，醛基与树脂上的酰肼基团进行反应形成腙键，从而被捕获；③糖基化蛋白或肽的释放。优点在于肼化学法的反应专一性高且无位点偏向性，有助于糖基化位点的确认，清洗过程中损失的蛋白较少。缺点是反应步骤多，条件较难控制，且操作复杂。

天冬胺酰亚胺是一种在酸性条件下形成的蛋白质药物，在Klaene等[23]的研究中，提出一个方法来检测和定量在完整蛋白质，通过肼捕获和化学衍生化琥珀酰亚胺，他们的独特优势是变种含琥珀亚酰胺衍生化后，可以很容易的通过亲和富集和色谱分离。异天冬氨酸的形成是普遍存在的翻译后修饰所产生的天冬酰胺脱酰胺或天门冬氨酸异构化，Alfaro等[24]在研究中使用肼捕获法来检测异天冬氨酸蛋白。

2.2 β-消除米氏加成反应

β-消除米氏加成反应广泛应用于O-糖肽的分离富集中（见图1）。Wells等[25]利用O-糖蛋白在碱性条件下发生β-消除反应，产生不饱和双键，再加入二硫苏糖醇（DTT）或生物素戊胺（BAP）进行米氏加成的方法使O-糖肽的糖基化位点被标记，标记后的多肽可通过亲和的方法富集。

图1 β-消除米氏加成法分离富集糖蛋白/糖肽[16]Fig.1 Isolation and enrichment of glycoproteins by using beta-elimination/Michael addition method

3 展望

约有超过50%的蛋白质发生糖基化，数据库中仅有10%左右注释为糖蛋白，糖蛋白/糖肽的特殊结构以及化学性质的不同使其分离富集的方法多种多样，其中硼酸法应用最为广泛，普适性强；β-消除米氏加成法的反应条件易与磷酸化蛋白等产生干扰；肼化学法操作复杂等。因此，在研究过程中结合不同方法的优势，使用多种富集方法对糖蛋白/糖肽进行更高效、更全面的分离富集，如凝集素法与肼化学法的结合，亲水介质纤维素与连续凝集素亲和法的集合等。

糖蛋白组学和蛋白质组学快速发展，分离富集和分析技术的成熟，糖蛋白质组学将会在完善表达蛋白质组、疾病蛋白质组生物标志物的发现以及药物靶点等临床应用中发挥重要的作用。为了更深入的研究糖蛋白/糖肽，还需鉴定、分析和分离富集等技术上的改革创新以及多种方法的结合。蛋白质翻译后修饰对于生物体内的新陈代谢和信号传导等过程扮演着重要的角色。糖链转移酶和代谢酶的基因芯片研究以及与糖链有关的计算机处理软件也正日益受到关注，通过基因手段改变病原体的糖蛋白的结构并阻止其与细胞结合，也成为分子水平上研究糖蛋白调控以及开展基因治疗的的重要靶标。

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Progress on the Enrichment of the Food-derived Glycoproteins and Its Application

YU Zhi-peng1，GUO Hui1，ZHAO Wen-zhu1，*，CHEN Yue-jiao1，DING Long2，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

There are many kinds of glycoproteins with complex and varied forms.Because of the low content of glycoproteins，the separation of high selectivity is the basis of in-depth study of purification and enrichment of glycoproteins.The method and application for enrichment of the foodborne glycoproteins were reviewed in this paper，aimed to provide a reference for the research of enrichment of glycoproteins or glycopeptides.

glycoprotein；isolation；purification；enrichment

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.046

2016-12-15

国家自然科学基金项目（31601479）；辽宁省科学事业公益研究基金项目（2016004004）；渤海大学博士启动项目（0515bs079）

于志鹏（1984—），男（汉），讲师，博士，研究方向：蛋白质及活性肽的功能研究与产品开发。

*通信作者