低压贮藏对甜米酒高级醇和酯的影响

杨东升，朱齐南

（海南大学材料与化工学院生物工程系，海南海口570228）

低压贮藏对甜米酒高级醇和酯的影响

杨东升，朱齐南

（海南大学材料与化工学院生物工程系，海南海口570228）

低压CO2贮藏海南甜米酒，是一种非热加工贮藏的方法。将进入酵母主发酵后期的甜米酒清液装入耐压容器中，利用酵母自产CO2所形成的压力对甜米酒进行保鲜贮藏。在带压贮藏期中，酵母生长受限于压力和CO2浓度，因而酒中大部分残糖在12个月贮藏后得以保留，使甜米酒依然具备甜的自然属性。压力贮藏令主要风味物质高级醇和酯类的生成受到抑制。高级醇在压力贮藏期前期生成量大，后期由于发生转化作用而有所减少，对风味影响较小。酯类在压力贮藏后期持续增加，主要是因为高级醇的酯化反应生成。主要酯成分乳酸乙酯在压力贮藏期间增加2.45倍，强化了其主要香味特征。

低压贮藏；甜米酒；高级醇；酯

甜米酒是海南最受欢迎的酒精气体饮料，主要产自五指山、保亭、白沙、琼中等黎族苗族地区[1]。原料采用当地产旱稻——山兰稻，山兰稻种类繁多，适宜酿甜酒的一般是糯山兰稻，外皮颜色略带红褐色。由于山兰稻产量较少，而甜米酒需求量大，因此，市面上出现了许多以普通糯米为原料酿成的甜米酒。因其相同的酿制工艺，成品口感基本不变。酒曲的采用各地不同，原始作坊多采用米粉加某些植物块茎等捣碎酿成的土制酒曲；现代作坊多采用市售酒曲，产出甜酒风格基本一致，淡紫红色，以甜味为主，略带酸，少许苦，酒精度约为5%～8%（体积分数），其中的特殊香气物质使海南甜米酒酒体丰满，具备良好的适口性。然而，甜米酒不容易保存，一般在25℃下放置3 d以上，酒质就会发生变化，主要体现在酒味冲，苦味重，甚至酸败。在冰箱（5℃）中也只能保存30 d。因此，如何延长其货架期是目前研究的重点。用加热的方法可以延长其货架期，像中国黄酒一样，通过加热杀灭微生物再装瓶包装[2]，但会使甜米酒失去特有的气体饮料的特性，同时容易使其特有的香气物质挥发掉。用非热处理的方法——低压CO2贮藏甜米酒使其保持原来的风味特色，通过定期抽样测定高级醇以及酯类的变化，研究其对主要香气物质的影响是十分必要的。

1 材料与方法

1．1 试验材料

糯米、甜酒曲：海南省保亭黎族苗族自治县县城；耐压（耐压0.2 MPa）PVC空瓶（加装压力表）：超市；正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、甲酸乙酯、丁二酸二乙酯（GR级）：阿拉丁试剂公司；无水乙醇（GR级）：广州化学试剂厂。

1．2 仪器设备

干燥空气罐（氮纯度79%）：海口金厚特种气体有限公司；高纯氮罐：海口金厚特种气体有限公司；GC-6890N气相色谱仪、DB-1701毛细管色谱柱：（30 mm×0.32 nm×1 μm）：Agilent Technologies；DL-5000B-B 离心机：上海安亭科学仪器厂；7001-A型CO2含量测定仪：广东华胜科学仪器厂。

1．3 试验方法

糯米预处理：糯米1 kg清洗并筛净于室温下晾干，用电蒸锅蒸煮30 min。将熟米自然摊凉至40℃～45℃。将甜酒曲研磨成粉末状备用。

甜米酒发酵：1 kg熟米置于发酵容器内，加入5 g酒曲充分搅拌。隔8层纱布盖上盖子置于室温（25℃）发酵约7 d。将发酵醪置于5 000 r/min离心机中离心20 min，取上清液分别密封和敞口贮藏于耐压PVC瓶中。敞口贮藏瓶口覆盖八层纱布，加盖。

甜米酒贮藏：甜米酒分别分瓶密封和敞口贮藏于耐压瓶中，分别置于恒温（5、25℃）室，定期取样检测，贮藏期一年。

CO2含量测定：用国产华胜CO2含量测定仪测定。

高级醇和酯含量测定：用高效气相色谱方法测定[3-4]。

样品预处理：酒液中含有部分CO2气体和小部分的淀粉、糊精、葡萄糖、蛋白质等非挥发性有机物，直接进样会对仪器进样口与色谱柱造成较大的危害，同时影响结果的精确度，因此先将酒液排气，再用双层纱布过滤，然后按乙醇测定的方法进行蒸馏，蒸馏时加入适量消泡油，同时加入6粒玻璃珠。准确收集馏出液95 mL后再经蒸馏水定容到100 mL摇匀，静止30 min后进样。

气相色谱条件为，进样量：1 μL；进样口温度：230 ℃，分流比：20 ∶1；载气类型：N2；流速：1.0 mL/min；柱温采用程序升温：初温50℃，保持5 min后以15℃升至220℃，保持9 min；检测器温度：250℃；氢气流量30 mL/min，空气流量300 mL/min，尾吹气流量20 mL/min。

残糖测定：斐林试剂法[5]。

乙醇含量测定：蒸馏密度瓶法。

酸度测定：精密pH计。

2 结果与分析

2.1 压力变化

澄清甜米酒分别分瓶密封和敞口贮藏于耐压瓶中，分别置于恒温（5、25℃）室，密封耐压瓶中压力迅速上升，可于贮藏2个月达到最大值，分别为0.13 MPa（25℃）和 0.1 MPa（5℃）（表 1）。贮藏期压力基本无变化。

表1 贮藏期间压力（相对）变化Table 1 Evolution of CO2top pressure(relative)during preservation

2.2 高级醇的变化

高级醇在贮藏期间浓度变化见图1～图5。

图1 正丙醇在贮藏期间浓度变化Fig.1 Evolution of n-propyl alcohol concentration during preservation

在甜米酒贮藏期间，由于受CO2影响，酵母生长受限，同时伴随高级醇生成的受限。在贮藏的前4个月，可以观察到敞口贮藏样品的高级醇增长曲线比密封的陡峭得多，接下来开始下降（图1～图5）。

乙酸乙酯和高级醇构成了黄酒的主要香气物质[6]。通过直接进样的气相色谱分析方法，结合大量的数据分析发现，随着贮藏年份的增加，黄酒中的异戊醇和β-苯乙醇是呈不断减少趋势的，同样被发现减少的还有糠醛、苯甲醛[7]。在敞口的环境下，黄酒中的酵母在残糖被耗尽之前将不会停止发酵，并不断生成酪醇、色醇等苦味高级醇[8]，总之，敞口发酵用利于积累各种高级醇[9]。而在极端环境下，如高压、高盐、高温下，酵母的生长代谢受到抑制，高级醇也就不能产生了。在CO2低压贮藏过程中，可以观察到酵母的生长受限，同时高级醇生成也比敞口贮藏低得多。图1～图5中显示了正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇和总高级醇在开始2个月压力贮藏期间增长幅度比敞口贮藏小得多，在后4个月中减少并轻微波动。可以说是压力减缓了高级醇的增长。

因为高级醇分别是氨基酸和糖代谢的产物，因此影响酵母对营养物质吸收的参数如温度等同样影响高级醇的生成[10]。图1～图5显示不管有没有压力存在，温度越高，高级醇生成量越大，而低温可以强化CO2的作用。在实际应用中，带压发酵已经被成功运用于补偿由于提高发酵温度带来的酒风味缺失。在发酵过程中逐渐加大施以0.1 MPa的压力，可以发现挥发性风味物质比敞口发酵有所减少。除了高级醇外，酯的含量因不同压力也会发生不同变化。在发酵期间，增加CO2压力用来减少因为升高温度而增加的高级醇。这项操作可以减少高达50%的高级醇，根据经验，压力发酵对应提高的发酵温度可以高达0.18 MPa[11]。

图2 异丁醇在贮藏期间浓度变化Fig.2 Evolution of isobutyl alcohol concentration during preservation

图3 异戊醇在贮藏期间浓度变化Fig.3 Evolution of isoamyl alcohol concentration during preservation

图4 β-苯乙醇在贮藏期间浓度变化Fig.4 Evolution of β-phenylethyl alcohol concentration during preservation

图5 总高级醇在贮藏期间浓度变化Fig.5 Evolution of total higher alcohols concentration during preservation

2.3 酯的变化

乳酸乙酯和乙酸乙酯是甜米酒中的主要挥发酯。本文研究了海南甜米酒中乳酸乙酯、乙酸乙酯、甲酸乙酯和丁二酸二乙酯在CO2压力贮藏下的变化，结果见图 6～图 10。

图6 乙酸乙酯在贮藏期间浓度变化Fig.6 Evolution of ethyl acetate concentration during preservation

图7 乳酸乙酯在贮藏期间浓度变化Fig.7 Evolution of ethyl lactate concentration during preservation

图8 甲酸乙酯在贮藏期间浓度变化Fig.8 Evolution of ethyl formate concentration during preservation

图9 丁二酸二乙酯在贮藏期间浓度变化Fig.9 Evolution of diethyl succinate concentration during preservation

从图7、图9可见乳酸乙酯和丁二酸二乙酯分别从0.1 mg/L上升到0.9 mg/L，从0.05 mg/L上升到0.6 mg/L。虽然乳酸乙酯增加了2.45倍，甲酸乙酯却只增加了10%（图8）。比较敞口贮藏，压力贮藏限制了酯类的生成量（图 6～图 10）。

中国黄酒贮藏过程中同样发现乳酸乙酯随着年份的增加而增加。而在封闭的环境下，在相对较短时期内发现总酯和乙酸乙酯的减少，癸酸乙酯的巨幅增加[12]。乳酸乙酯的快速增加意味着酒液当中乳酸的增加，当然这取决于乳酸菌的作用。因此，在发酵的后期，很可能存在着酵母与乳酸菌的竞争，酵母与乳酸菌均生长良好直到受到CO2压力和酒精的抑制作用为止，富余的乳酸用来生成乳酸乙酯[13]。

压力和温度是甜米酒生产的主要参数，正如前面所述，温度有助于强化压力对酯生成的影响。低温（5℃）下生成的酯比高温（25℃）下生成的酯要少（图6～图10）。增加发酵温度能减少发酵时间，提高CO2压力可以改善由于增加温度带来的负面的风味物质的影响[14]。目前研究认为，CO2不单消极影响酵母的细胞数量和酯的形成速度，同时也影响高级醇的生成。相同的麦汁可以通过压力和温度对酯类的调控生成不同风格的啤酒[15]。合适的温度和压力调控可以影响酵母生长，CO2的生成，总酯和高级醇的浓度，生成风格适宜的酒体[16]。

密封发酵容器可以积累CO2同时积累大量挥发性风味物质，这些存在于发酵醪中的挥发性物质同时也是酵母的毒素，继而对生产造成影响。甜米酒的感官多样性取决于贮藏期间所采取的方式。在12个月的贮藏期中，除了挥发性风味物质，其它风味物质如氨基酸、乳酸等也需要进行深入研究。

图10 总酯在贮藏期间浓度变化Fig.10 Evolution of total esters concentration during preservation

2.4 残糖和乙醇含量的变化

残糖和乙醇在贮藏期间浓度变化见表2、表3。

表2 残糖在贮藏期间浓度变化Table 2 Evolution of residual sugar concentration during preservation

表3 乙醇在贮藏期间浓度变化Table 3 Evolution of ethanol concentration during preservation

海南甜米酒以甜味著称。在发酵阶段，酒醪中的营养成分被吸收，生成酒精、CO2和其它代谢副产物。一旦发酵容器密闭后，中止了发酵，残糖留在酒液中，生成的产品即为甜米酒。如果相反，让发酵反应继续进行，残糖会被耗尽，产品不再有甜味。中国其它地区的甜酒有广西甜米酒，含糖25%[17]和湖北甜米酒，含糖27%[18]。但是，本研究的甜米酒经过7 d发酵后，含糖量只有8%（表2），含乙醇含量却高达7%（体积分数）（表3），分别比广西甜米酒4.5%（体积分数）和湖北甜米酒2.7%（体积分数）高。中国甜米酒的乙醇含量通常在4%～10%（体积分数）之间。日本米酒乙醇含量一般为10%～13%（体积分数）[19]。

在25℃和5℃的压力贮藏期间，甜米酒残糖分别下降了34%和20%；而敞口贮藏的样品残糖则分别下降83%和81%（表2）。另一方面，在25℃和5℃的压力贮藏期间乙醇分别增加10%和7%（体积分数）；25℃敞口贮藏的样品乙醇含量快速升至10.01%（体积分数），5℃敞口贮藏的样品乙醇含量则在8个月后才升至9.6%（体积分数）（表3）。后略有下降，原因可能为挥发所致。

压力贮藏使甜米酒保留了大部分的残糖，保持了酒体的甜味，而敞口贮藏的酒样已不具备甜味特征。压力贮藏同时使甜米酒的酒度保持在合适的水平，有醇厚感，而敞口贮藏酒样的酒精度较高，已不具备饮用的适口性。

3 结论

1）CO2压力影响并减缓高级醇和酯类生成，高级醇在贮藏后期参与酯化反应，含量逐渐减少。较高温度可以促进高级醇和酯的生成，与压力配合对高级醇和酯生成进行正负调控。低温加CO2压力贮藏可以延长甜米酒货架期，保持海南甜米酒原始风味。

2）甜米酒中的酯类在CO2压力贮藏后期持续增加，主要是因为高级醇的酯化反应生成。主要酯成分乳酸乙酯在压力贮藏期间增加2.45倍，强化了其主要香味特征。

3）甜米酒的敞口贮藏耗尽残糖，而低温CO2压力贮藏残糖仅下降20%，乙醇仅增加7%。12个月的贮藏期仍保持酒体的甜味特征。

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Effect of Low Pressure Preservation to Higher Alcohols and Esters in Sweet Rice Wine

YANG Dong-sheng，ZHU Qi-nan
（Department of Bioengineering，College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Preservation of sweet rice wine treated with low pressure of carbon dioxide is non-thermal processing.Sweet rice wine was preserved well by the low pressure of carbon dioxide at different temperatures.Growth of yeast was stuck by the pressure and the carbon dioxide in the wine.Most residual sugar was retained and kept the wine sweet sensory after 12 months storage.The production of higher alcohols and esters were inhibited by preservation with pressure.A great mount of higher alcohols were produced during the initial phase and a decline followed due to the esterification.Conversely，esters increased during the post preservation.Ethyl lactate was the dominated ester increased by 2.45 times after preservation by pressure，which enhanced the principal aroma of the wine.

low pressure preservation；sweet rice wine；higher alcohol；ester

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.045

2016-12-08

海南省科技厅科研基金资助项目（312079）

杨东升（1966—），男（汉），副研究员，本科，研究方向：生物化工。