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马齿苋多糖体外免疫调节活性研究

2017-09-04陶贵斌何慧楠李雪惠刘雪莹齐滨刘莉

食品研究与开发 2017年17期
关键词:马齿苋多糖活性

陶贵斌,何慧楠,李雪惠,刘雪莹,齐滨,刘莉

(长春中医药大学药学院,吉林长春130117)

马齿苋多糖体外免疫调节活性研究

陶贵斌,何慧楠,李雪惠,刘雪莹,齐滨*,刘莉*

(长春中医药大学药学院,吉林长春130117)

以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型研究马齿苋多糖对细胞吞噬能力的影响,刺激产生NO含量,释放IL-6、TNF-α来考察其对巨噬细胞免疫活性的影响。结果表明马齿苋多糖可通过增强巨噬细胞吞噬能力,释放免疫因子等方面增强巨噬细胞免疫活性。

马齿苋多糖;巨噬细胞;免疫调节

马齿苋(Portulace oleracea L.)为马齿觅科一年生肉质草本植物,是一种药食两用植物,主要以野生为主,西欧发达国家己经将其发展栽培成为蔬菜以供食用。马齿苋在我国资源储备极其丰富,其所包含的化学成分多种多样,主要有氨基酸、多糖类、有机酸、黄酮类、香豆素、生物碱、强心苷、蒽醌、维生素和矿物质等化合物[1-5]。马齿苋具有广泛的药理作用,在抗衰老、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化,以及保肝护肝等方面具有重要的作用[6-9]。马齿苋多糖是近年来新发现的一种新的活性成分,具有提高免疫力,延缓衰老,抗肿瘤等活性[10-11],国内外学者对马齿苋多糖的药理活性的研究多集中于动物实验,从细胞水平去探索马齿苋多糖的生物活性报道较少,本研究以马齿苋多糖提取物为研究对象,探讨马齿苋多糖对小鼠巨噬细胞的调节作用,从细胞水平研究其体外免疫调节的作用,为马齿苋多糖的活性研究提供新的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

马齿苋:采于吉林省长春市市郊。

小鼠巨噬细胞样细胞株RAW264.7(ATCCTIB-71):中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

DMEM 培养基:Gibco公司;噻唑蓝(MTT):Thiazoly公司;二甲基亚砜(DMSO):天津天泰精细化学品有限公司;TNF-α酶联免疫测定试剂盒、IL-6酶联免疫测定试剂盒:上海朗顿生物科技有限公司;脂多糖(LPS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris):Sigma 公司;Griess:上海碧云天生物技术有限公司。

Infinite 200 Pro型酶联免疫检测仪:瑞士TECAN公司;3111型CO2培养箱:Thermo Forma公司。

1.2 方法

1.2.1 马齿苋多糖的制备

准确称量干燥的马齿苋100 g,粉碎,将粉末置于圆底烧瓶中加入95%乙醇,搅拌、80℃水浴,冷凝回流6 h,除去乙醇,干燥。干燥后粉末水煎煮3次,离心取上清液,4℃静置过夜,取上清溶液真空浓缩,浓缩液加无水乙醇沉淀过夜,Sevage法除蛋白,干燥,制得马齿苋多糖(POP)样品。采用苯酚硫酸法测得多糖含量为23.35%,精密称取多糖干粉20 mg,加10 mL无菌PBS缓冲液溶解,用0.22 μm滤膜无菌过滤分装,-20℃保存,备用。待做细胞实验时,取出用磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液稀释成 200、100、50 μg/mL。

1.2.2 细胞吞噬能力实验

取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液,细胞密度为6×105个/mL接种于96孔板,每孔100 μL,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养6 h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20 μL,补加80 μL培养基,每个浓度设6个复孔,空白组以同体积无菌PBS代替,阳性对照组加入同体积20 μg/mL LPS,培养24 h。用中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力,每孔加入100 μL 0.075%的中性红溶液,继续孵育1h后,吸出孔内培养基,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)吸去残留中性红,加入150 μL90%乙酸乙醇裂解液,充分混匀,测定每孔在550 nm处的光度值(OD)。

1.2.3 NO含量检测

取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液,细胞密度为2×106个/mL接种于96孔板,每孔100 μL,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养6 h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20 μL,补加80 μL培养基,每个浓度设6个复孔,空白组以同体积无菌PBS代替,阳性对照组加入同体积20 μg/mL LPS,培养24 h。采用Griess法测定NO含量:标准孔加入浓度为100 μmol/L 的亚硝酸 0、10、20、30、40、50 μL,加蒸馏水补足50 μL,样品孔分别加入各组培养基50 μL,之后再加入50 μL Griess试剂,振摇10 min,测定各孔于540 nm处的光度值(OD),根据标准孔绘制出亚硝酸浓度与光度值的标准曲线,并计算各样品孔NO浓度。

1.2.4 IL-6、TNF-α 含量检测

细胞培养液中IL-6的测定参照小鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明,将各组细胞上清液在10 000 r/min、4℃下离心10 min,吸取上清20 μL进行酶联免疫吸附反应,在450 nm测定吸光度值(OD值),计算IL-6含量。

细胞培养液中TNF-α的测定参照小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明,将各组细胞上清液在10 000 r/min、4℃下离心10 min,吸取上清20 μL进行酶联免疫吸附反应,在450 nm测定吸光度值(OD值),计算TNF-α含量。

1.2.5 数据处理

所有数据均以均值±标准差表示。t检验采用SPSS11.5统计软件包完成,以P<0.05表示差异显著;P<0.01表示差异极其显著。

2 结果与讨论

2.1 马齿苋多糖对细胞吞噬能力的影响

细胞具备吞噬能力的高低被当做衡量细胞活性的一个关键指标。本研究采取中性红法来评价马齿苋多糖对RAW264.7小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响,结果见图1。

图1 马齿苋多糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响(,n=9)Fig.1 Effect of purslane polysaccharides on the phagocytic ability of RAW264.7(,n=9)

如图1所示,从马齿苋多糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响可以看出,细胞吞噬能力与样品浓度呈量效关系。结果表明马齿苋多糖具有增强细胞吞噬能力的作用(P<0.01)。

2.2 马齿苋多糖对RAW264.7细胞释放NO的影响

NO是氧化应激反应中的主要介质,氧化应激能参与并加剧炎症反应,因此,NO的水平与多种炎症疾病的发病机制密切相关。本研究采用Griess法检测细胞培养上清液的亚硝酸盐含量,从而间接反应RAW264.7细胞的NO分泌水平。Griess法测定NO含量所得标准曲线为y=0.003 3x+0.040 9,R2=0.999 7,由标准曲线得各组NO浓度如图2所示。

图2 马齿苋多糖对RAW264.7细胞释放NO的影响(,n=9)Fig.2 Effect of purslane polysaccharides on NO production of RAW264.7(,n=9)

由图2可知空白组细胞产生NO最少,为(6.64±0.61)μmol/L,阳性对照组细胞产生NO最多,为(26.68±0.88)μmol/L,实验组细胞产生NO含量随马齿苋多糖浓度的增加而增加。马齿苋多糖不同浓度与空白组相比均有显著性(P<0.01),且各实验组NO浓度均低于阳性对照组。

2.3 马齿苋多糖对RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α的影响

LPS可诱导巨噬细胞产生一系列炎症反应。被激活的RAW264.7巨噬细胞可以释放出多种具有免疫调节作用的细胞因子。IL-6作为一种多功能细胞因子,在免疫应答和炎症反应中具有重要作用。马齿苋多糖对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响如图3所示。

图3 马齿苋多糖对RAW264.7细胞分泌IL-6和TNF-α的影响(±s,n=9)Fig.3 Effect of purslane polysaccharides on IL-6 and TNF-α production of RAW264.7(,n=9)

从图3可以看出,各组IL-6浓度均高于空白组。马齿苋多糖对RAW264.7细胞分泌IL-6有促进作用,和空白组对比具有显著性意义(P<0.01)。

TNF-α可以杀死肿瘤细胞或起到抑制其生长的功效,可以提高中性粒细胞的吞噬、增殖和分化能力。马齿苋多糖各浓度均能促进分泌TNF-α(P<0.01),浓度为 200 μg/mL 时,TNF-α 含量最高为(3.53±0.11)ng/mL,是空白组的9.8倍。各组TNF-α浓度均小于阳性对照组,说明马齿苋多糖促进RAW264.7细胞分泌TNF-α的作用温和。

3 结论

巨噬细胞是机体非特异性免疫的关键细胞,病原微生物入侵机体时首先被巨噬细胞识别、吞噬,巨噬细胞的吞噬能力影响免疫应答强弱。本研究中用不同浓度的马齿苋多糖培养RAW 264.7细胞,研究细胞吞噬能力、NO分泌能力、IL-6和TNF-α释放能力。吞噬中性红实验结果表明马齿苋多糖能够激活RAW264.7细胞并具有增强其吞噬作用的能力。NO在细胞的生理调节中扮演着信使及效应分子的角色,实验结果表明,马齿苋多糖可以提高RAW264.7细胞的NO分泌水平,且与LPS模型对照组比较中同时具有差异显著性,证明其对NO释放水平的提高是在一定安全范围之内,并没有达到导致产生炎症的效果。

巨噬细胞除对病原微生物的吞噬消灭作用外,还有免疫递呈的作用。巨噬细胞免疫递呈作用是通过释放IL-6、TNF-α等免疫因子来实现的,这些免疫因子刺激T/B细胞,实现免疫级联反应。TNF-α是一个经典的炎症指标,具有诱导多种炎症因子产生,最终导致细胞凋亡的作用,处于炎症级联反应的中心环节,其表达量的多少可以直接反映炎症的严重程度。IL-6作为一种多功能细胞因子,具有抗炎和致炎的双向功能,其作用与组织中的含量有关。本实验研究结果表明:马齿苋多糖对RAW264.7细胞释放这两种细胞因子具有较显著的增强作用。

由上述结果可知,马齿苋多糖可通过增强巨噬细胞吞噬能力、杀死病原微生物的能力和释放免疫因子三方面增强巨噬细胞免疫活性,实验结果表明马齿苋多糖具有较好的活化巨噬细胞的活性,可以作为增强免疫的保健品和食品的原材料。

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The Study of Immunoregulatory Activity in vitro of Purslane Polysaccharides

TAO Gui-bin,HE Hui-nan,LI Xue-hui,LIU Xue-ying,QI Bin*,LIU Li*
(College of Pharmacy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,Jilin,China)

The effects of purslane polysaccharides on phagocytosis of macrophages RAW264.7 were determined to stimulate the production of NO content,to release of IL-6,TNF-α to investigate the immune activity of macrophages.The results show that purslane polysaccharides can enhance macrophage phagocytosis,release of immune factors to enhance the macrophage immune activity.

purslane polysaccharides;macrophage;immunoregulation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.039

2016-12-14

国家自然科学基金(81274038);吉林省教育厅“十三五”科学技术研究规划项目(JJKH20170725KJ)

陶贵斌(1980—),男(汉),硕士,从事中药分析研究。

*通信作者:刘莉(1978—)女,博士,硕士研究生导师,从事中药活性研究;齐滨(1978—)男,博士,硕士研究生导师,从事中药活性研究。

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