低聚半乳糖指纹图谱的构建

张志国

（唐山三元食品有限公司，河北唐山301501）

低聚半乳糖指纹图谱的构建

张志国

（唐山三元食品有限公司，河北唐山301501）

构建低聚半乳糖指纹图谱，为低聚半乳糖生产工艺研究和质量控制提供方法，为低聚半乳糖聚合度研究提供支持。利用离子色谱仪分离低聚半乳糖的分离度和灵敏度，构建低聚半乳糖离子色谱指纹图谱，并绘制商业化的低聚半乳糖离子色谱指纹图谱。离子色谱的分离度和灵敏度非常适合低聚半乳糖指纹图谱的绘制，利用离子色谱法绘制了商业化低聚半乳糖的指纹图谱，并确定了低聚半乳糖离子色谱指纹图谱的糊精指纹区，初步判定了低聚半乳糖组分聚合度。通过绘制低聚半乳糖指纹图谱确定了商业化低聚半乳糖原料中含有15种以上的低聚半乳糖组分，不同公司生产的低聚半乳糖的指纹图谱有显著不同。

低聚半乳糖；指纹图谱；离子色谱

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）在母乳低聚糖中含量是最高的，所以认为低聚半乳糖是各种功能性低聚糖中益生功能比较强的一种益生因子[1-2]。

作为功能性低聚糖，低聚半乳糖主要具有如下的生理功能：促进肠道双歧杆菌的增殖，改善矿物质元素的吸收和防止骨质减少，预防、治疗便秘；改善脂质代谢，降低血清胆固醇的含量；生成营养物质，改善营养状况[3-5]。

在工业生产中，以乳糖为原料，利用β-半乳糖苷酶的转糖苷作用生产低聚半乳糖。通常，低聚半乳糖的分子结构是在半乳糖或葡萄糖分子上通过β-D-（1→6）半乳糖苷键或β-D-（1→4）半乳糖苷键连接1个～7个半乳糖基，研究发现β-D-（1→3）半乳糖苷键也比较常见，也包含少数的β-D-（1→2）半乳糖苷键。因为是以乳糖为原料生产，β-半乳糖苷酶的作用是可逆的，工业化的低聚半乳糖通常是葡萄糖、半乳糖、乳糖、半乳二聚糖、半乳三聚糖、半乳四聚糖、半乳五聚糖等的混合物。其中影响低聚半乳糖组分结构和比例的主要因素在于低聚半乳糖生产时使用的β-半乳糖苷酶的来源及其生产工艺。已经测得的低聚半乳糖不同聚合度的糖苷键结构式超过15种，表1中列出了已经测得的低聚半乳糖不同聚合度的糖苷键结构式[3，6-10]。

低聚半乳糖组分比较复杂，研究人员仍然对低聚半乳糖组分功效、生产工艺和生产用半乳糖苷酶的筛选进行大量的研究，用来提高低聚半乳糖的生产效率、纯度。绘制低聚半乳糖的指纹图谱，尽可能分离低聚半乳糖的全部组分，可以为低聚半乳糖生产工艺的改进研究和分子聚合度分布研究提供数据，为低聚半乳糖的质量控制提供方法[11-12]。

表1 低聚半乳糖不同聚合度的糖苷键结构式Table 1 Structural formula of glycosidic bond of different degree of polymerization in GOS

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

低聚半乳糖：唐山三元食品有限公司提供；葡萄糖标准品（≥99.5%）、半乳糖标准品（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；果糖标准品（≥99%）、蔗糖标准品（≥98%）：贵州迪大科技有限责任公司；乳糖标准品（≥99%）、麦芽糖标准品（≥99%）：上海时代生物科技有限公司；β-半乳糖苷酶（12 U/mg，500 kU/瓶）、乙酸钠（99%）、氢氧化钠（50%，1.515 g/mL）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

乙腈（色谱纯）：天津市天昊化工有限公司；磷酸二氢钾（色谱纯）、三水磷酸氢二钾（色谱纯）、十二水磷酸氢二钠（色谱纯）、氢氧化钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效离子色谱仪（ICS-5000，配脉冲安培检测器PAD）、CarboPac PA200 Guard Column（3 mm×50 mm）、CarboPac PA200 Analytical Column（3 mm×250 mm）：美国Dionex公司；Millipore超纯水处理装置：美国Millipore公司；电子分析天平：梅特勒－托利多仪器公司；精密pH仪（PHS-3C）：南宁庆华化工有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制

1）葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖标准储备溶液（浓度分别为1 mg/mL）：分别精密称取6种糖的标准品100 mg至100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

2）葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖混合标准工作溶液（浓度分别为10 μg/mL）：分别吸取6种糖的标准储备溶液1.0 mL，转移至100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

3）磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.0）：22.0 g磷酸二氢钾和6.0 g三水磷酸氢二钾溶于水中，稀释至1 L。120℃高压灭菌器中灭菌30 min。

4）盐酸溶液（1 mol/L）：量取 83.0 mL浓盐酸溶于超纯水中，稀释至1 L。

5）氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠，用100 mL无二氧化碳超纯水溶解，转移至1 L容量瓶中，用无二氧化碳超纯水定容至刻度，储存在具胶塞试剂瓶中。

6）β-半乳糖苷酶溶液（2 000 U/mL）：称取活性约为12 U/mg的来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的半乳糖苷酶16.67g，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液制成100mL、半乳糖苷酶最终活性为2 000 U/mL的溶液。在pH 4.5和25℃条件下，1个单位可将1.0 mol o-硝基苯基-D-半乳糖苷水解为o-硝基苯酚和D-半乳糖。混悬液不用时储存于冰箱中。使用前充分振摇混悬液，酶混悬液制备后8 h内使用。

7）乙腈溶液（20%）：量取200 mL乙腈，转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

8）乙腈溶液（3%）：量取30 mL乙腈，转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

9）氢氧化钠溶液（250 mmol/L）：量取 50%氢氧化钠溶液13.2 mL，转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

10）乙酸钠溶液（1mol/L）：精密称取乙酸钠 82.03g，用无二氧化碳超纯水100 mL溶解转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

1.3.2 样品处理

分别称取低聚半乳糖原料0.100 0 g，用超纯水溶解转移到1 000 mL容量瓶中，并稀释到刻度，摇匀，制成0.1 mg/mL的样品待测溶液，用0.2 μm微孔滤膜过滤。

1.3.3 离子色谱条件

1）色谱柱：CarboPacPA200AnalyticalColumn（3mm×250 mm），保护柱 CarboPac PA200 Guard Column（3 mm×50 mm）；

2）色谱柱温度：30℃；

3）流动相：洗脱梯度见表2；

4）流动相流量：0.4 mL/min；

5）PAD 灵敏度：3 μC；

6）进样量：20 μL；

7）在正式进样检测前，按照梯度洗脱模式运行，以0.4 mL/min流速稳定基线，当基线稳定后即可进样。

采用CarboPac PA200分析柱分析低聚半乳糖的流动相梯度见表2。

表2 采用CarboPac PA200分析柱分析低聚半乳糖的流动相梯度Table 2 Eluent gradient of galactooligosaccharides analyzed by CarboPac PA200 analytical column with IC

续表2 采用CarboPacPA200分析柱分析低聚半乳糖的流动相梯度Continue table 2 Eluent gradient of galactooligosaccharides analyzed by CarboPac PA200 analytical column with IC

2 结果与讨论

2.1 低聚半乳糖分离方法

构建低聚半乳糖指纹图谱，主要是要发现低聚半乳糖组分和比例的复杂性，研究低聚半乳糖组分和比例的变化规律，为低聚半乳糖工艺研究和质量控制提供技术支撑。选择离子色谱分离主要是因为离子色谱分离低聚半乳糖的效率要高于高效液相色谱，也有比较好的检出限和灵敏度。在目前的分离技术水平下，CarboPac PA200色谱柱对低聚糖有好的分离效率，这一点是氨基柱、糖柱无法比的，在试验中也得到了证实。

在流动相比例的选择上，因为氢氧化钠溶液可以比较好的分离单糖、低聚糖，而乙酸钠可以把低聚糖、多聚糖成分有效的洗脱。所以用超纯水、250 mmol/L氢氧化钠、1 mol/L醋酸钠作流动相，通过梯度洗脱和6种糖的标准品完成单糖、二糖、低聚糖的分离，并通过糊精的洗脱试验完成色谱柱的完全洗脱。

2.2 低聚半乳糖指纹图谱构建

用葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖6种糖的标准溶液判断低聚半乳糖原料中单糖和双糖分离效果，以及低聚糖的分离效果，出峰顺序依次是半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖。标准品的色谱图见图1。

图1 标准样品的分离结果Fig.1 Isolation of standard sample

图2 低聚半乳糖样品的IC指纹图谱（样品1）Fig.2 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 1）

图3 低聚半乳糖样品的IC指纹图谱（样品2）Fig.3 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 2）

图4 添加糊精的低聚半乳糖样品的IC指纹图谱（样品3）Fig.4 IC fingerprint of galactooligosaccharides including dextrin（sample 3）

用设定好的离子色谱条件，进行了4批次不同公司生产的低聚半乳糖原料指纹图谱的构建，样品2中添加了糊精形成样品3，结果见图2～图6。

4批次低聚半乳糖原料中都分别检出了含量不等的半乳糖、葡萄糖、乳糖，并且半乳糖、葡萄糖、乳糖在保留时间5 min～11.5 min内出峰。除去乳糖和保留时间显示为少量果糖的组分以外，保留时间在7.5 min～35 min内的组分，进过酶解试验证实超过15种的色谱组分为低聚半乳糖成分。对添加糊精的低聚半乳糖原料构建指纹图谱，结果表明保留时间在37 min～45 min为糊精的指纹图谱区，见图4。经过反复试验确认，在确定的离子色谱条件下，分离低聚半乳糖原料时，如果在保留时间区间37 min～45 min内出现连续有规律的、峰高规律性变小的一系列色谱峰时，即可判断添加了糊精，必要时可以用添加糊精的低聚半乳糖做验证。

分析构建的低聚半乳糖离子色谱指纹图谱发现，不同公司生产的低聚半乳糖在乳糖、半乳糖、葡萄糖含量上有明显差异，乳糖、半乳糖、葡萄糖含量和比例直接影响了低聚半乳糖各组分的含量和比例，同时决定了低聚半乳糖组分的聚合度分布。

2.3 低聚半乳糖指纹图谱的组分分析

对4批次低聚半乳糖原料指纹图谱进行对比分析，结果见图7。

图5 低聚半乳糖样品的IC指纹图谱（样品4）Fig.5 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 4）

图6 低聚半乳糖样品的IC指纹图谱（样品5）Fig.6 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 5）

图7 4种低聚半乳糖样品的IC指纹图谱Fig.7 IC fingerprints of four kinds of galactooligosaccharides

通过对4批次低聚半乳糖进行聚合度分析，并结合低聚半乳糖原料生产商提供的组分含量，可以初步判定低聚半乳糖各聚合度组分在离子色谱指纹图谱的保留时间区间。聚合度为2的低聚半乳糖组分在保留时间为8 min～14 min，聚合度为3的低聚半乳糖组分在保留时间为14 min～22 min，聚合度为4的低聚半乳糖组分在保留时间为22 min～30 min，聚合度为5以上的低聚半乳糖组分在保留时间为30 min～37 min内全部被洗脱出来。

对照4批次低聚半乳糖原料指纹图谱分析，发现11个主要色谱峰，分别在保留时间为8 min～14 min区间8.4 min的1号峰、9.9 min的2号峰和13.1 min的3号峰，保留时间为14 min～22 min区间的16.6 min的4号峰、17.7 min的5号峰，保留时间为22 min～30 min区间的24.9 min的6号峰、26.3 min的7号峰、28.1 min的8号峰、28.7min的9号峰，保留时间为30min～37min区间内的32.4 min的10号峰、34.3 min的11号峰。

4个批次低聚半乳糖样品的离子色谱指纹图谱中，主要色谱组分分布见表3。

从表3中可以看出4个批次低聚半乳糖的组分含量既有共同点又有明显区别，比如4批次低聚半乳糖全部含有较多的4号组分；样品1中包含特有的8号组分；5号组分和7号组分是样品2特有的，但是样品2中6号组分含量很低；样品4和样品5含有较多的10号组分，是区别于其它样品特有组分，这2个样品中3号组分含量很低，两个样品2号组分、4号组分、6号组分、9号组分、10号组分的含量区别明显，很容易区分。4批次不同公司生产的低聚半乳糖原料在离子色谱指纹图谱中的组分区别明显，能够通过离子色谱指纹图谱进行区分辨别。

表3 不同公司生产的低聚半乳糖的主要离子色谱组分Table 3 Major IC composition of galactooligosaccharides produced by different company

2.3 不同生产工艺对低聚半乳糖色谱组分的影响

为了验证低聚半乳糖离子色谱指纹图谱的应用效果，采用新旧两种生产工艺（生产用半乳糖苷酶不同）在同一实验室进行低聚半乳糖的生产，用离子色谱构建两种工艺生产的低聚半乳糖的指纹图谱，结果见图8。

图8 不同工艺低聚半乳糖样品的IC指纹图谱对比Fig.8 Comparison of IC fingerprints of galactooligosaccharides of different technique

从图8中可以看出，生产低聚半乳糖用的半乳糖苷酶不同，生产的2种低聚半乳糖指纹图谱中离子色谱组分和含量比例有着明显差异，从而可以用指纹图谱法研究生产工艺对低聚半乳糖组分和比例的影响。

3 结论

低聚半乳糖指纹图谱研究的目的是研究和控制低聚半乳糖的质量，通过指纹图谱的特征，既能有效考察低聚半乳糖主要特征峰的种类和含量，又可以通过构建比如糊精等添加物的指纹区鉴别低聚半乳糖的质量，还可以通过指纹图谱的主要特征峰研究低聚半乳糖的益生功效。本次研究得出以下结论：

1）通过构建低聚半乳糖的离子色谱指纹图谱，确认并发现低聚半乳糖的复杂性，利用离子色谱分离低聚半乳糖共发现了超过15种组分。

2）通过对样品进行添加糊精的离子色谱分离试验，确认了低聚半乳糖的糊精指纹图谱区。

3）通过对比发现，低聚半乳糖原料中乳糖、半乳糖、葡萄糖含量和比例直接影响了低聚半乳糖中各个组分的含量和比例，同时决定了低聚半乳糖组分的聚合度分布。

4）结合聚合度研究，初步得到了低聚半乳糖各聚合度组分在离子色谱指纹图谱的保留时间区间。

5）通过对4批次低聚半乳糖原料在离子色谱指纹图谱中的组分对比发现，主要特征峰有明显区别，能够通过离子色谱指纹图谱进行区分辨别不同公司生产低聚半乳糖。

6）利用不同半乳糖苷酶生产低聚半乳糖，得到了有明显区别的指纹图谱，确认了不同生产工艺对低聚半乳糖各组分含量和比例的影响。

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Construction of Galactooligosaccharides Fingerprints

ZHANG Zhi-guo
（Tangshan Sanyuan Foods Co.Ltd.，Tangshan 301501，Hebei，China）

Galactooligosaccharides（GOS）fingerprint can be used to provide a method for GOS commercial production technology research，and quality control of GOS production.And it also can provide support for the research of GOS degree.Ion chromatography was be used to study the separation degree and sensitivity of the GOS，then determined the method of constructing GOS fingerprint and mapping commercial GOS fingerprint.By comparison，the separation and sensitivity of ion chromatography were very suitable for mapping the fingerprints of GOS.With ion chromatography，the fingerprint of commercial GOS were drew，and determined the dextrin fingerprint region of GOS.Then the degree of polymerization of GOS was determined preliminarily.Through mapping the fingerprints of GOS，more than 15 kinds of GOS were identified from commercial GOS raw material contains，and there were significant differences between different companies production of GOS.

galactooligosaccharides（GOS）；fingerprints；ion chromatograph（IC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.034

2016-12-21

张志国（1977—），男（汉），高级工程师，硕士，研究方向：食品分析及乳品科学。