紫甘蓝提取物对食源性致病菌的抑菌作用

陈颖慧

（永城职业学院食品化工系，河南永城476600）

紫甘蓝提取物对食源性致病菌的抑菌作用

陈颖慧

（永城职业学院食品化工系，河南永城476600）

以7种食源性致病菌作为供试菌株，利用牛津杯法评估紫甘蓝提取物的抑菌效果，测定紫甘蓝提取物的最低抑制浓度（MIC），并分析其热稳定性，最后利用透视电镜试验揭示紫甘蓝提取物的抑菌机理。结果表明：紫甘蓝提取物对7种食源性致病菌具有较好的抑菌效果，其中对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果最好（MIC=0.2%），对蜡样芽孢杆菌和阪崎克罗诺杆菌的抑菌效果较差（MIC=0.4%）。紫甘蓝提取产物在60℃以下的杀菌效果较好，90℃，20 min下紫甘蓝提取物抑菌作用全部失活。紫甘蓝提取物是通过较低的pH值和破坏菌株的细胞形态和细胞膜通透性发挥抑菌作用。

紫甘蓝提取物；抑菌作用；最低抑制浓度；热稳定性；透射电镜

紫甘蓝又名红甘蓝、紫洋白菜或紫包菜，属于十字花科，富含多种维生素及矿物元素，深受广大消费者的喜爱[1-2]。此外，紫甘蓝中含有花青素、多酚和黄酮等多种活性物质，具有抗氧化和抑制病原微生物的作用。张会香等分析了紫甘蓝色素对大肠肝菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑菌作用，并评估了其抗氧化活性[3]。杨晓玲等则在揭示紫甘蓝色素抑菌能力的基础上，研究了紫甘蓝色素的热稳定性[4]。然而，紫甘蓝中的活性物质并非只有紫甘蓝色素一种，因此有必要对紫甘蓝提取物做进一步的系统研究，并分析其抑菌的机理。本研究以常见的食源性致病菌为供试菌株，确定紫甘蓝提取物对这些食源性致病菌的抑菌作用及最低抑制浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），分析其热稳定性，并利用对照试验和透射电镜试验揭示紫甘蓝提取的抑菌机理，从而为紫甘蓝的综合利用提供新思路。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料、菌株与试剂

紫甘蓝：新鲜无损坏变质，购于沃尔玛超市。

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）和单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）：东北农业大学乳品科学教育部重点实验室馈赠。

溶菌肉汤培养基（lysogeny broth，LB）、胰酪胨大豆琼脂培养基（Tryptose Soya Agar，TSA）：北京雷根生物技术有限公司；盐酸、磷酸缓冲液、戊二醛、乙醇和丙酮：西陇化工股份有限公司；饿酸固定液、醋酸铀和柠檬酸铅：天津市大陆化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

牛津杯：上海桥星贸易有限公司；TGL-24MC台式高速冷冻离心机：杭州艾普仪器设备有限公司；AS.3Y分析天平：中科先创科技（深圳）有限公司；PHS-300型台式酸度计：江苏盛奥华环保科技有限公司；日立H-7650透视电镜：上海铸金分析仪器有限公司。

2 方法

2.1 紫甘蓝提取物的制备

利用向延菊等[5]报道的方式对紫甘蓝提取物进行制备，得到的紫甘蓝提取物溶液在40℃的真空干燥箱中干燥，从而得到紫甘蓝提取物干粉。

2.2 菌悬液的制备

从冻存管中取100 μL菌液在TSA培养基中三区划线，供试菌株的纯化。挑取单菌落，在LB培养基中扩大培养，培养条件为37℃，20 h。取2 mL上述培养液，在8 500 r/min下离心10 min，小心除去上清液，并用生理盐水进行洗涤，最后将得到的菌泥溶于1 mL生理盐水中，制成细胞悬液，并调整浓度达到7.0 logCFU/mL[6]。

2.3 紫甘蓝提取物抑菌效果的测定

利用牛津杯法评估紫甘蓝提取物的抑菌效果，首先配制TSA培养基，涂布供试菌株，在无菌环境下将3只牛津杯（内径6 mm、外径8 mm、高10 mm）均匀的垂直放置在TSA培养基中，配制3%的紫甘蓝提取物溶液加到牛津杯中，之后在37℃条件下培养24 h，最后计算抑菌圈大小[7]，相同pH值下的盐酸和无菌蒸馏水处理组为对照组。

2.4 紫甘蓝提取物MIC值计算及热稳定性试验

调整紫甘蓝提取物的浓度为：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，取7.0 logCFU/mL的菌液进行MIC的测定，具体步骤参考赵敏等[8]的报道。将MIC的紫甘蓝提取在 60、70、80、90 ℃和 100 ℃下分别处理 10、20、30 min，计算紫甘蓝提取物在不同温度处理后的抑菌率。

2.5 透射电镜试验

为了了解紫甘蓝对食源性致病菌的抑制作用，分别对用LB肉汤培养和含有0.5%紫甘蓝提取物的生理盐水对金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌进行处理，培养1 h后利用透视电镜观察供试菌株细胞变化，整个过程包括取材、固定、脱水、浸透、包埋、修块、切片、正染色和透视电镜观察[9]。

3 结果与分析

3.1 紫甘蓝提取物抑菌效果的评估

利用牛津杯法评估紫甘蓝提取物对供试食源性致病菌的抑菌效果，结果如表1所示。

表1 紫甘蓝提取物抑制效果评估Table 1 The inhibition effect assessment of purple cabbage extract

由表1可知，0.3%紫甘蓝提取物对7种食源性致病菌都具有较好的抑菌作用，其中对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈的直径大于14.0 mm，对蜡样芽孢杆菌和阪崎克罗诺杆菌的抑菌效果较差，抑菌圈为10.0 mm～12.0 mm。为了分析紫甘蓝提取物抑菌效果和pH值的关系，以相同pH值的HCl为对照组，HCl（pH=3.02）对7种食源性致病菌有一定的抑菌效果，但是远低于紫甘蓝提取物，这表明紫甘蓝提取物对供试菌株的抑菌作用与其pH值有一定的关系，但是并不能完全解释其抑菌机理。

3.2 紫甘蓝提取物对食源性致病菌的MIC

紫甘蓝提取物对食源性致病菌的MIC结果如表2所示。

由表2可知，紫甘蓝提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC为0.2%，对金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和单增李斯特氏菌的MIC为0.3%，对蜡样芽孢杆菌和阪崎克罗诺杆菌的MIC为0.4%，上述结果和3.1中对紫甘蓝提取物抑菌效果评估的结果趋势一致。

表2 紫甘蓝提取物对供试菌种的MICTable 2 The MIC of purple cabbage extract to tested strains

3.3 紫甘蓝提取物热稳定分析

对紫甘蓝提取物进行不同温度的热处理，并计算其抑菌率，结果如表3所示。

由表3可知，紫甘蓝提取物的抑菌效果随着处理温度的提高而降低，当80℃处理30 min时，紫甘蓝提取物对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌、阪崎克罗诺杆菌和单增李斯特氏菌的抑菌率为0，当紫甘蓝提取物在90℃下处理30 min或100℃下处理10 min时，紫甘蓝提取物对所用供试菌株失去抑菌作用。紫甘蓝提取物热稳定分析结果表明紫甘蓝提取物在大于80℃的高温处理下会导致失活。

3.4 透视电镜分析

表3 温度对紫甘蓝提取物抑菌效果的影响Table 3 The influence of temperature on bacteriostatic effect of purple cabbage extract

图1 透视电镜分析结果Fig.1 The results of the analysis of SEM

0.5%紫甘蓝提取物处理后的金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌的透视电镜分析结果如图1所示。

由图1可知，经过0.5%紫甘蓝提取物的处理，金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的细胞壁被破坏，菌体形态发生了改变，细胞内部的细胞液外泄，这说明紫甘蓝提取物通过破坏供试菌株的细胞壁，使其细胞液排出而发挥其抑菌效果。

4 结论与讨论

紫甘蓝提取物对7种食源性致病菌具有较好的抑菌作用，但是紫甘蓝提取物对热的稳定性较差，当温度大于90℃时，20 min的处理就会导致抑菌作用消失，这可能是因为在高温下紫甘蓝提取物中的活性物质，包括有机酸、多酚、花青素和黄酮类化合物会挥发或失活，这启示我们在提取紫甘蓝提取物和发挥其抑菌作用的过程中要避免高温处理。同时，相同pH值盐酸对食源性致病菌也具有一定的抑菌作用，这说明紫甘蓝提取物的抑菌作用与其较低的pH值有关。

同时，在相同的pH值作用下，紫甘蓝提取物的抑菌效果优于HCl，这说明紫甘蓝提取物的抑菌效果还另有原因。透视电镜分析表明供试菌株的细胞形态被破坏、细胞液外泄，这些结果和已有的研究结果相似[6，9]，这说明紫甘蓝提取物中有机酸和多酚类物质发挥了抑菌作用。有机酸作为小分子可以透过菌体的细胞壁和细胞膜，从而改变细胞内的pH值，导致细胞形态发生变化，其次多酚类物质可以改变细胞膜的通透性，从细胞液排除，从而导致菌体的死亡[10-11]。

[1]李昌文,张丽华,纵伟,等.紫甘蓝蔬菜纸片加工工艺的研究[J].食品研究与开发,2016,37(20)：115-118

[2]任虹,李婷,李强,等.加热方法对紫甘蓝花色苷组分及其清除自由基活性的影响[J].中国食品学报,2016,16(6)：231-240

[3]张会香,杨世军,梁闪坐.紫甘蓝色素的抑菌性和抗氧化性研究[J].食品工业,2010(4)：64-66

[4]杨晓玲,郭彦东.紫甘蓝色素的稳定性及抑菌性[J].食品科学,2010,31(23)：32-35

[5]向延菊,白红进,张美娥,等.黑果枸杞果实提取物的抑菌效果研究[J].食品研究与开发,2016(1)：26-29

[6]徐春华.牡丹花提取物抑菌作用的研究[J].食品研究与开发,2016,37(15)：163-165

[7]刘冬梅,李理,杨晓泉,等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发,2006,27(3)：110-111

[8]赵敏,谭钢文,唐小异,等.十种中药提取物与抗生素合用对铜绿假单胞菌最小抑菌浓度影响的体外实验[J].湖南师范大学学报(医学版),2011,8(4)：80-83

[9]Li R,Fei P,Man C X,et al.Tea polyphenols inactivate Cronobacter sakazakii isolated from powdered infant formula[J].Journal of Dairy Science,2016,99(2)：1019-1028

[10]Kim T J,Silva J L,Weng W L,et al.Inactivation of Enterobacter sakazakii by water-soluble muscadine seed extracts[J].International Journal of Food Microbiology,2009,129(3)：295-299

[11]钱丽红,陶妍,谢晶.茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理[J].微生物学通报,2010,37(11)：1628-1633

Bacteriostatic Effect of Purple Cabbage Extract to Foodborne Pathogenic Bacteria

CHEN Ying-hui
（Department of Food and Chemical Engineering，Yongcheng Vocational College，Yongcheng 476600，Henan，China）

Seven foodborne pathogenic bacteria were chosen as the tested strains.The oxford cup method was used to evaluate the antibacterial activity of the purple cabbage extract.The minimum inhibitory concentration（MIC）of of purple cabbage extract to tested strains were calculated.The thermal stability of purple cabbage extract was analyzed.Finally，bacteriostatic mechanism of purple cabbage extract was revealed using perspective electron microscopy（SEM）.The results showed that purple cabbage extract had a good bacteriostatic effect to 7 foodborne pathogenic bacteria.The bacteriostatic effects of purple cabbage extract to Escherichia coli and Salmonella were best（MIC=0.2%），meanwhile,the bacteriostatic effects of purple cabbage extract to Bacillus cereus and Cronobacter sakazakii were worst（MIC=0.4%）.The bacteriostatic effect of purple cabbage extract was favourable under less than 60℃，which was inactivated thoroughly with the treatment of 90℃，20 min.Purple cabbage extract played a bacteriostatic role through lower pH and damaging cell morphology and cell membrane permeability.

purple cabbage extract；bacteriostatic effect；minimum inhibitory concentration；thermal stability；perspective electron microscopy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.008

2017-03-19

陈颖慧（1981—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。