纳滤技术在河豚鱼皮胶原肽螯合锌脱盐中的应用研究

郭洪辉，洪专

（国家海洋局第三海洋研究所海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门361005）

纳滤技术在河豚鱼皮胶原肽螯合锌脱盐中的应用研究

郭洪辉，洪专*

（国家海洋局第三海洋研究所海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门361005）

采用纳滤膜技术对河豚鱼皮胶原肽螯合锌进行了脱盐浓缩试验，研究不同分子量的纳滤膜对螯合锌脱盐效果及回收率的影响，确定最佳的纳滤除盐工艺。试验结果表明，最适用膜为截留分子量700 Da的卷式纳滤膜。在渗滤过程中，当加入6倍料液体积的纯水后，河豚鱼皮胶原肽螯合锌基本达到了脱盐的效果，产品的回收率为73.82%。河豚鱼皮胶原肽螯合锌经纳滤膜脱盐后，蛋白质含量从46.6%提高到82.04%，含锌量为12.8%，去除了大量的无机盐杂质，达到了分离纯化的目的。

纳滤；河豚鱼皮；胶原肽螯合锌；脱盐

鱼产品在加工过程中会产生大量的鱼副产物，如鱼皮、鱼鳞、鱼头、鱼骨及内脏等，这部分约占鱼鲜重的50%左右[1-4]。其中，鱼皮在副产物中约占7%～8%，研究显示，鱼皮中胶原蛋白含量丰富，约占蛋白质总量的60%～80%，是鱼体各部位中含量最高的一类蛋白，可以作为胶原蛋白提取的良好原料[5-6]。以鱼皮作为原料，采用酸提或酶解等方法提取胶原蛋白，具有多种生物学功能，已在化妆品、保健食品、医药卫生等领域显现出良好的应用前景[4-6]。近年来，人们开始关注鱼皮胶原肽与金属螯合的研究，肽的金属螯合物如Fe、Zn等的生物学利用率比无机盐高，且无毒副作用，是理想的人体或动物的微量元素补充剂[7-10]。

目前，肽的金属螯合物脱盐主要采用乙醇沉淀法，并不适用于大规模的分离纯化[1，7-8，11-12]。而膜分离技术是一种简单、快速、高效、选择性好且经济节能的新技术，其中纳滤膜过滤技术就是介于传统分离范围超滤和反渗透之间的一种新型分子级膜分离技术，纳滤膜的表层孔径范围在纳米级（10-9m），平均孔径为2 mm，相对分子质量截留范围（MWCO）为200 Da～1 000 Da[13]。其纳滤膜结构及性能上的特点，使得纳滤膜分离技术在食品工业、水处理等领域得到广泛的应用[14]。本试验在河豚鱼皮胶原肽螯合锌制备过程中，采用了不同截留分子量的纳滤膜对其进行脱盐的分离纯化，并对脱盐的工艺参数进行了优化，为今后的工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

河豚鱼皮胶原肽：国家海洋局第三海洋研究所海洋生物资源综合利用工程技术研究中心自制[15]；卷式纳滤膜芯：美国GE公司；醋酸锌、氢氧化钠、盐酸、氯化铵、铬黑T、乙二胺四乙酸二钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

30 L双层玻璃反应釜、DFY-20L/20低温恒温反应浴：巩义市予华仪器有限责任公司；1812卷式膜设备：三达膜科技有限公司；Milli-Q超纯水纯化系统：美国millipore公司；RC 6+大型高速冷冻离心机：美国热电公司；SG3便携式电导率仪：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；Epsilon2-6D冻干机：德国Christ公司。

1.3 试验方法

1.3.1 河豚鱼皮胶原肽螯合锌的制备

将5 kg河豚鱼皮洗净后，先经过30 L 0.2%NaOH水溶液处理，沥干洗至中性，然后用30 L 0.3%H2SO4水溶液处理，沥干洗至中性，再加入5 L的纯水在60℃恒温加热搅拌2 h，最后经过复合酶解后得到30 L的河豚鱼皮胶原肽水溶液[15]。用酸碱调节至一定的pH值，加入锌离子与胶原肽的摩尔比为1∶2的醋酸锌，加热至60℃～70℃，反应2 h，经冷冻高速离心后得到淡黄色的河豚鱼皮胶原肽螯合锌水溶液。

1.3.2 卷式纳滤膜的的筛选

由于河豚鱼皮胶原肽螯合锌的分子量约为1000Da，为了减小损失分别选用不同截留分子量（1 000、700、450 Da）的卷式纳滤膜，对反应得到的30 L河豚鱼皮胶原肽螯合锌水溶液进行纳滤除盐，当透过液的电导率降低到100 μs/cm时，停止纳滤，浓缩料液并冷冻干燥[16]。通过测定膜通量、透过液电导率和含锌量的变化等指标来确定最适的纳滤膜及加水量。

3种卷式纳滤膜的工作参数如表1所示。

表1 不同卷式纳滤膜的工作参数Table 1 Operating parameter of spiral nanofiltration membrane with different MWCO

1.3.3 不同卷式纳滤膜对锌离子透过率的测定

将醋酸锌溶解于超纯水中，得到1 g/L的醋酸锌水溶液，选用不同截留分子量的卷式纳滤膜在相同条件下进行纳滤循环，同时接取浓缩液和透过液，并对其锌离子浓度进行测定，按照公式（1）计算不同卷式纳滤膜的锌离子透过率。

式中：X为卷式纳滤膜对锌离子的透过率；C1为透过液的锌浓度，mol/L；C2为浓缩液的锌浓度，mol/L。

1.3.4 膜通量的测定[17]

式中：J为膜通量，L/（h·m2）；V为透过液的体积，L；t为超滤所用的时间，h；s为膜的面积，m2。

1.3.5 透过液中锌离子浓度的变化

量取10 mL的透过液置于锥形瓶中，分别加入10 mL的pH 10.0 NH3-NH4Cl缓冲液和适量的铬黑T指示剂，然后用0.01 mol/L的Na2EDTA标准溶液滴定至溶液变蓝，停止滴定，记录消耗的Na2EDTA标准溶液毫升数，按照公式（3）计算锌离子的浓度[18]。

式中：C为锌浓度，mol/L；V为消耗的Na2EDTA的体积，mL；c为 Na2EDTA 的浓度，mol/L；v为透过液的体积，mL。

1.3.6 电导率的测定

电导率仪经标准液校准后，用超纯水洗净探头，滤纸擦干，将探头浸入10 mL样品液中，待读数稳定后读取数值。

1.3.7 产品回收率的测定

式中：X为过膜后产品的回收率，%；m1为过膜后冻干样的质量，g；m2为相同体积未过膜料液冻干后的质量，g。

1.3.8 产品成分的测定

水分含量的测定：直接干燥法（GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》）。

粗蛋白含量的测定：微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》）。

锌含量的测定：采用Na2EDTA滴定法。

2 结果与讨论

2.1 河豚鱼皮胶原肽螯合锌主要成分分析

取未过膜的河豚鱼皮胶原肽螯合锌冻干样，进行主要成分分析，结果如表2所示。

表2 未过膜前河豚鱼皮螯合锌的主要成分Table 2 The main components of collagen peptide chelated zinc

由表2可以看出，在未过膜前，河豚鱼皮胶原肽螯合锌的蛋白含量较低，并含有大量的无机盐杂质，如果不加以去除，会严重影响最终产品的质量[19]。

2.2 卷式纳滤膜膜通量随时间的变化

不同截留分子量卷式纳滤膜膜通量随时间变化关系如图1所示。

图1 不同截留分子量卷式纳滤膜膜通量随时间变化关系Fig.1 Relationship between membrane fluxes of spiral nanofiltration membrane with different MWCO and time

膜通量是膜分离过程中的一个重要工艺运行参数之一，可以由此判断膜分离的效率。当30 L河豚鱼皮胶原肽螯合锌水溶液使用不同截留分子量卷式纳滤膜进行循环脱盐时，对其膜通量进行实时的监测，结果如图1所示。从图1可以看到，在相同温度和操作压力下，3种卷式纳滤膜的膜通量随着时间的变化都有所下降，但是下降程度有所不同，可能是循环过程中，少量的蛋白或样品吸附在膜芯表面，使得膜孔有一定程度的堵塞[16]。截留分子量为1 000 Da的卷式纳滤膜，膜通量随时间变化较小，可能是孔径较大的原因。而700 Da和450 Da的卷式纳滤膜膜通量下降较多，尤其是450 Da的卷式纳滤膜，运行60 min时，膜通量从10.2 L/（h·m2）下降到6.9 L/（h·m2）。膜通量的降低会使使用时间延长，从而影响生产效率。

2.3 透过液电导率及锌浓度随加水体积的变化

在脱盐时，最重要的是渗滤过程，即在接出透过液的同时不断地向浓缩液中加入纯水稀释浓缩液的浓度以提高脱盐率。因此，在脱盐时需在浓缩液中加入足够的纯水，以保证除盐效果[20]。在渗滤过程中，检测透过液的电导率随时间的变化如图2所示。

图2 不同截留分子量卷式纳滤膜透过液电导率随加水体积的变化关系Fig.2 Relationship between conductivity of permeate treated by spiral nanofiltration membrane with different MWCO and the volume of water

由图2可知，当往浓缩液中加入纯水后，透过液的电导率迅速下降。截留分子量为1 000 Da的卷式纳滤膜，在加入4倍体积的纯水后，透过液电导率即下降到99.6 μs/cm。而700 Da和450 Da的卷式纳滤膜由于孔径较小，对盐的截留率较大，分别需要加入6倍和9倍体积的纯水，才使料液达到了基本除盐的效果。因此，可以看出，卷式纳滤膜的截留分子量过小，不仅延长脱盐的时间，降低生产效率，还会造成大量水资源的浪费。

表3为不同卷式纳滤膜对锌离子的透过率。

表3 不同截留分子量的卷式纳滤膜对锌离子的透过率Table 3 Permeation rate of zinc ion of spiral nanofiltration membrane with different MWCO

从表3可以看到，1 000 Da和700 Da的卷式纳滤膜锌离子的透过率为66.16%和60.52%，均大于60%；而450 Da的卷式纳滤膜锌离子的透过率较低，为52.31%，但是也超过50%，说明这3种卷式纳滤膜对游离的锌离子均有较好的透过性，能用于除去料液中未参与螯合反应的游离锌离子。

不同截留分子量卷式纳滤膜透过液浓度随加水体积的变化关系见图3。

图3 不同截留分子量卷式纳滤膜透过液浓度随加水体积的变化关系Fig.3 Relationship between zinc concentration of permeate treated by spiral nanofiltration membrane with different MWCO and the volume of water

在渗滤脱盐的过程中，随着加水倍数的增加，透过液的锌离子浓度会逐渐下降，如图3所示。透过液锌离子的初始浓度约为0.046 mol/L，当加入4倍体积的超纯水后，1 000 Da的卷式纳滤膜透过液锌离子浓度降低到0.69 mmol/L，基本去除了游离的锌离子。700 Da和450 Da的卷式纳滤膜在加入6倍体积和9倍体积的纯净水后，锌离子浓度分别降低到0.78 mmol/L和0.83 mmol/L，降低了98.3%和99.2%，此时游离的锌离子浓度已经很低，基本达到脱盐的目的。

2.4 3种卷式纳滤膜的脱盐效果对比

表4是3种不同截留分子量卷式纳滤膜的耗时、耗水量和回收率的比较。

表4 3种卷式纳滤膜的脱盐效果比较Table 4 Desalination effect of spiral nanofiltration membrane with different MWCO

1 000 Da的卷式纳滤膜孔径较大，虽然所加水量最少，耗时也最短，但是螯合锌的回收率过低，只有21.33%，在脱盐的同时损失了大量的螯合锌样品。450 Da的卷式纳滤膜耗时20 h，加水量为9倍体积的纯净水，虽然回收率较其他两种膜高，但是生产效率较低，造成水资源的较大浪费。综合考虑，截留分子量为700 Da的卷式纳滤膜回收率为73.82%，最适合于河豚鱼皮胶原肽螯合锌的脱盐除杂。

2.5 河豚鱼皮胶原肽螯合锌冻干样主要成分分析

河豚鱼皮胶原肽螯合锌水溶液经截留分子量为700 Da的卷式纳滤膜脱盐浓缩后，冷冻干燥并检测其主要成分，结果如表5所示。

表5 河豚鱼皮螯合锌冻干样的主要组成成分Table 5 The main components of collagen peptide chelated zinc

与表2相比，经纳滤膜脱盐后，河豚鱼皮胶原肽螯合锌的蛋白含量显著提高，并去除了大量的无机盐杂质，达到了分离纯化的目的。

3 结论

对于河豚鱼皮胶原肽螯合锌的脱盐，纳滤膜分离是一种稳定、有效的分离方法，其在脱除盐分的同时还可实现螯合锌的浓缩。本研究是在实验室小试的基础上，选用了3种不同截留分子量的卷式纳滤膜对河豚鱼皮胶原肽螯合锌溶液进行除盐浓缩，确定了最佳的纳滤除盐工艺。截留分子量为700 Da的卷式纳滤膜能够有效地除去螯合锌中大量的无机盐杂质。当加入6倍体积的纯水后，透过液电导率可降低到100 μs/cm，锌离子浓度降到0.78 mmol/L，基本可达到除盐的效果，螯合锌产品的回收率为73.82%。河豚鱼皮胶原肽螯合锌经纳滤膜脱盐后，蛋白质含量显著提高，并去除了大量的无机盐杂质，达到了分离纯化的目的。

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Appllication of Nanofiltration Membrane in Desalination of Collagen Peptide Chelated Zinc from Puffer Skin

GUO Hong-hui，HONG Zhuan*
（Engineering Research Center of Marine Biological Resource Comprehensive Utilization，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources，Xiamen 361005，Fujian，China）

Nanofiltration membrane separation was applied for the desalination of collagen peptide chelated zinc from puffer skin.The effect of nanofiltration membrane with different molecular weight cut off（MWCO）on the desalination efficiency and recovery of collagen peptide chelated zinc from puffer skin was studied.The optimal process of desalination by nanofiltration was found.The result showed that the optimal membrane was nanofiltration membrane with MWCO 700 Da.In diafiltration process，when six times feed volume of pure water was added，the collagen peptide chelated zinc was mainly desalted，and the recovery was 73.82%.The protein content of collagen peptide chelated zinc from puffer skin was increased from 46.6%to 82.04%and the zinc content was 12.8%.Much impurity of inorganic salt was removed and the collagen peptide chelated zinc from puffer skin was purified.

nanofiltration；puffer skin；collagen peptide chelated zinc；desalination

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.006

2016-12-01

福建省科技重大专项（2014NZ0001-2）

郭洪辉（1982—），女（汉），助理研究员，博士，主要从事海洋生物资源综合利用研究。

*通信作者：洪专，男，教授级高工。