大豆7S蛋白-糖体系晚期糖基化终产物形成因素

刘贵梅，章鼎敏，李 普，卢永翎，郑铁松，吕丽爽*

（南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097）

大豆7S蛋白-糖体系晚期糖基化终产物形成因素

刘贵梅，章鼎敏，李 普，卢永翎，郑铁松，吕丽爽*

（南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097）

目的：在大豆蛋白糖基化改性过程中会引发非酶糖基化反应，形成有害的晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs），为提高食品安全性，模拟糖基化加工条件，构建大豆7S蛋白-糖体系模型，考察影响该体系AGEs形成的因素并进行有效调控。方法：采用荧光光谱法（λex/λem＝340 nm/465 nm）检测糖种类、还原糖质量浓度、pH值、反应温度、抑制剂种类及其浓度对AGEs形成的影响，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表征有害产物的形成及抑制效果。结果：糖种类为果糖、蛋白质与葡萄糖质量浓度配比1∶4、pH 9.2、反应温度121 ℃条件下产生荧光性AGEs的作用效果最强，4 种黄酮类化合物槲皮素、染料木素、芦丁和木犀草素对荧光性AGEs的形成均可达到较好的抑制效果，且呈现良好的剂量-效应关系。结论：糖的种类与抑制剂种类对AGEs的形成有一定影响；降低还原糖质量浓度、降低pH值和降低反应温度，添加0.1 mmol/L大豆源染料木素可有效抑制大豆加工过程中有害产物AGEs的形成。

大豆7S蛋白-糖体系；糖基化；荧光性晚期糖基化终产物；荧光光谱；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白糖基化反应是碳水化合物以共价键形式与蛋白质分子中的α-或ε-氨基相连接的非酶促反应[1]，通过糖基化作用导致食品的褐变，对于食品的颜色、风味、质构等产生了重要的影响。糖与蛋白质分子中的氨基反应生成席夫碱（Schiff base），席夫碱经过分子重排后生成较为稳定的Amadori中间产物，再通过脱水、氧化、缩合等一系列反应，最终形成不可逆的晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs），同时席夫碱以及Amadori中间产物等可以通过自身的氧化作用生成酮醛类化合物，然后生成AGEs[2]。研究表明，摄入过多的外源性AGEs[3-4]或体内较多内源性AGEs的积累[5]，会引发阿茨海默症、糖尿病、动脉粥样硬化、肾脏疾病等病症，加快人体衰老的进程[6-10]。

大豆是一种丰富的植物蛋白资源，被广泛应用于肉制品、乳制品、面制品、方便食品、冷冻食品等几十类产品中。运用超速离心沉降法对大豆蛋白进行分离，可分为2S、7S、11S和15S[11]，其中7S蛋白含量约为37%[12]。大豆7S蛋白是由α、α’和β这3 种亚基通过疏水相互作用结合而成的三聚体糖蛋白，分子质量约为180～210 kD[13]。与其他蛋白相比，大豆7S蛋白分子中的二硫键和—SH较少，因此凝胶硬度低，但其赖氨酸含量稍高，疏水性氨基酸较多，表面活性强，故乳化性、起泡性较好[14-15]。

黄酮类化合物是广泛存在于自然界，基本母核为2-苯基色原酮类化合物，其种类数量繁多，结构复杂多样。研究证明黄酮类化合物如槲皮素、芦丁、染料木素、葛根素、儿茶素、花青素等对非酶糖基化反应具有抑制作用[16-20]。目前，在大豆蛋白改性中常用的糖有果糖[21]、木糖[22]、葡萄糖[23]、乳糖[24]、蔗糖[21]等。但是考虑到价格因素通常选择葡萄糖作为美拉德反应的底物。通过对大豆蛋白的糖基化改性可以明显改变大豆7S球蛋白的溶解性[25]、稳定性[26]、乳化性[27]、凝胶性[28]等蛋白功能性，并广泛应用于工业化生产。而在针对大豆蛋白高温加工及糖基化改性过程中产生的美拉德反应AGEs，对安全性构成极大隐患。目前，针对大豆蛋白高温加工及糖基化改性过程中，有害产物AGEs的形成过程、含量的监控及其抑制方法，国内外尚鲜见相关报道。本实验通过构建大豆7S蛋白-糖基化模型，采用酶标仪检测AGEs的含量，考察糖种类、蛋白质与还原糖的质量浓度配比、pH值、反应温度、抑制剂种类以及添加量对AGEs形成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

根据文献[29]的方法对低温脱脂大豆粕分离提纯制备得大豆7S蛋白。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司；槲皮素、染料木素、芦丁、木犀草素（均为色谱级） 南京广润生物试剂有限公司；丙烯酰胺、N-N甲叉双丙烯酰胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷、溴酚蓝、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；考马斯亮蓝、无水乙醇 南京化学试剂有限公司；β-巯基乙醇、冰醋酸 南京赛吉科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2104N电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；XW-80A微型涡旋混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司；HH-6数显恒温水浴锅、HH-S数显恒温油浴锅 金坛市富华仪器有限公司；KQ-300B超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；PHS-3C数字式pH计 上海三信仪表厂；F200多功能酶标仪 瑞士帝肯贸易有限公司；GL-22M超高速离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-24D型夹芯式垂直电泳槽 北京市六一仪器厂；JY600C型稳压稳流定时电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖种类对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

用浓度为0.2 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶解大豆7S蛋白、葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖，在10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液，2 mL质量浓度为12 mg/mL的各种糖溶液和2 mL PBS，使得7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度为4 mg/mL。混匀，置于100 ℃沸水浴中反应0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。解冻后15 000 r/min冷冻离心30 min，取300 μL上清液用酶标仪测定λex/λem＝340 nm/465 nm处相对荧光值，以相对荧光值表征AGEs含量（下同）。以PBS代替糖溶液作为对照，做3 组平行实验。

1.3.2 蛋白质与糖的质量浓度配比对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

用浓度为0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液，分别加入2 mL质量浓度为6、12、18、24 mg/mL葡萄糖，再加入2 mL PBS溶液，使得7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度分别为2、4、6、8 mg/mL。混匀，置于100 ℃沸水浴中反应0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。解冻后15 000 r/min冷冻离心30 min，取300 μL上清液用酶标仪测定λex/λem＝340 nm/465 nm处相对荧光值。以PBS代替糖溶液作为对照，做3 组平行实验。1.3.3 pH值对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

分别用浓度为0.2 mol/L、pH值为6.5、7.2、9.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL质量浓度为12 mg/mL的葡萄糖溶液，再加入2 mL PBS，使得7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度为4 mg/mL。混匀，置于100 ℃沸水浴中反应0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。解冻后15 000 r/min冷冻离心30 min，取300 μL上清液用酶标仪测定λex/λem＝340 nm/465 nm处相对荧光值。以PBS代替糖溶液作为对照，做3 组平行实验。

1.3.4 反应温度对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

用浓度为0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL质量浓度为12 mg/mL的葡萄糖溶液，再加入2 mL PBS，使得7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度为4 mg/mL。混匀，分别置于60 ℃恒温水浴、100 ℃沸水浴、121 ℃恒温油浴中反应0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。解冻后15 000 r/min冷冻离心30 min，取300 μL上清液用酶标仪测定λex/λem＝340 nm/465 nm处相对荧光值。以PBS代替糖溶液作为对照，做3 组平行实验。

1.3.5 抑制剂种类与浓度对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

用浓度为0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL质量浓度为12 mg/mL的葡萄糖溶液，再分别加入2 mL浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mmol/mL的槲皮素（或木犀草素、芦丁、染料木素）溶液作为样品组，使得大豆7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度为4 mg/mL。以PBS代替抑制剂作为空白组。将反应物于100 ℃沸水浴中反应120 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。解冻后15 000 r/min冷冻离心30 min，取300 μL上清液用酶标仪测定λex/λem＝340 nm/465 nm处相对荧光值，按照下式计算AGEs抑制率。

式中：Rfu样品组为抑制剂样品组相对荧光值；Rfu空白组为空白组相对荧光值。

1.3.6 SDS-PAGE分析7S-大豆蛋白糖基化

1.3.6.1 样品制备

用浓度为0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在4 个10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL质量浓度为12 mg/mL的葡萄糖溶液，再加入2 mL PBS，使得7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度为4 mg/mL。混匀，置于100 ℃沸水浴中反应0、15、30、60 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。在3 个10 mL样品管中加入2 mL质量浓度为6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL质量浓度为12 mg/mL的葡萄糖溶液，再分别加入2 mL浓度为0.1、0.5、1.0 mmol/mL的染料木素溶液，使得7S蛋白的终质量浓度为2 mg/mL，还原糖的终质量浓度为4 mg/mL。混匀，置于100 ℃沸水浴中反应60 min后，迅速置于-80 ℃冷冻贮藏备用。将7 个样品解冻后15 000 r/min冷冻离心10 min，取沉淀加入1 mL样品缓冲液混匀，沸水浴加热5 min，取出后冷却至室温备用。

1.3.6.2 SDS-PAGE分析

制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔上样量为10 μL，接通电源进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），浓缩胶中电流设置为10 mA，进入分离胶后设置电流为20 mA。电泳结束后小心取下凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色2 h，取出凝胶清洗后浸入脱色液，置于摇床进行振荡脱色，每2 h更换一次脱色液，直至脱色液无明显颜色为止。取出凝胶，置于凝胶成像仪中进行拍照分析。

2 结果与分析

2.1 糖的种类对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

图1 糖的种类对大豆7S蛋白-糖体系AGEs形成的影响Fig. 1 Effect of sugar type on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

由图1可知，4 种糖均与大豆7S蛋白反应生成了AGEs，且随着反应时间的延长，AGEs的生成量呈现不断上升的趋势。同时这4 种糖与大豆7S蛋白反应后，AGEs的生成量之间有显著的差异，在同一时间点，果糖产生的AGEs含量最多，其余依次为葡萄糖、乳糖、蔗糖。当反应时间为120 min时，果糖产生的AGEs含量约为蔗糖的2 倍。其中，果糖和葡萄糖是单糖，而乳糖和蔗糖为二糖，分子质量较大，对其与蛋白质氨基发生的羰氨反应造成了一定的空间位阻[30]，糖分子质量的增加可以推迟美拉德反应进入高级阶段，并且对其有明显的抑制作用[31]。另外，果糖、葡萄糖、乳糖为还原性糖，而蔗糖为非还原性糖，大豆蛋白糖基化产生AGEs的还原性糖活性高于非还原性糖。这与Bunn等[32]研究表明酮糖比醛糖具有更高的反应活性相一致。Jing等[33]发现核糖与酪蛋白的反应速率大于葡萄糖和果糖与酪蛋白的反应速率，即五碳糖比六碳糖更易和蛋白产生AGEs，且单糖比双糖也更易反应。

2.2 糖质量浓度对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

图2 糖质量浓度对大豆7S蛋白-糖体系AGEs形成的影响Fig. 2 Effect of sugar concentration on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

由图2可知，随着大豆7S蛋白-糖体系中糖比例的增加，糖基化产生的AGEs含量也在不断上升，糖质量浓度与AGEs生成量呈明显剂量-效应关系。当蛋白质与还原糖质量浓度配比为1∶2、1∶3、1∶4时，这3 个比例的AGEs生成量之间差别不是很大，但显著高于1∶1的生成量。这是由于蛋白质的含量一定时，随着糖质量浓度的增加，反应物分子间碰撞的几率也大大提高，从而有利于糖基化反应的进行，但当糖质量浓度增加到一定程度时，蛋白质与糖分子间的空间位阻导致分子间碰撞的几率减小，糖基化反应减弱[34]。

2.3 pH值对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

由图3可知，随着反应体系pH值（6.5、7.2、9.2）的增加，大豆7S蛋白与还原糖产生的AGEs含量增加。当pH值为6.5与7.2时，AGEs的生成量差别不大，但当pH值达到9.2时，AGEs生成的量明显增加，当反应时间为120 min时，pH 9.2条件下AGEs生成量约为pH 6.5和pH 7.2的2 倍，且反应时间从30 min开始呈剧烈上升趋势，120 min时的生成量约为30 min时的2.2 倍，说明碱性环境更有利于促进糖基化反应的进行，这是由于N-葡萄糖胺在偏酸性环境中易被水解[35]，因此糖基化改性条件应尽量控制在中性偏酸环境。

图3 pH值对大豆7S蛋白-糖体系AGEs形成的影响Fig. 3 Effect of pH on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

2.4 反应温度对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

图4 反应温度对大豆7S蛋白-糖体系AGEs形成的影响Fig. 4 Effect of temperature on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

由图4可知，反应温度（60、100、121 ℃）对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs的形成具有显著性影响，随着反应温度的升高，大豆蛋白糖基化产生的AGEs含量明显增加。在60 ℃时，AGEs的生成量较低，且在0～15 min增加后便趋于平稳。当温度升高到100 ℃时，AGEs含量在从15 min开始呈剧烈增加趋势，当反应时间为120 min时，100 ℃条件下产生的AGEs含量达到60 ℃的2.1 倍。当温度升高到121 ℃时，AGEs含量继续显著增加，120 min时，121 ℃条件下产生的AGEs含量达到60 ℃的2.9 倍。

2.5 抑制剂种类与浓度对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的影响

由图5可知，黄酮类化合物对大豆蛋白糖基化产生的AGEs均有一定的抑制效果，当添加量达到0.5 mmol/L时，4种黄酮类化合物的抑制率均高于60%，且随着抑制剂浓度（0.05～5.00 mmol/L）的增加，抑制率均明显升高，说明抑制剂的浓度与抑制率存在显著的量效关系。在各浓度条件下，染料木素的抑制效果最好，其次为槲皮素、芦丁、木犀草素。其中染料木素和槲皮素的抑制效果较为接近，抑制率均明显高于芦丁和木犀草素，当添加浓度为0.10 mmol/L时，染料木素与槲皮素的抑制率均已高达60%以上，即可达到较好的抑制效果。当浓度继续增大到5.00 mmol/L时，染料木素与槲皮素的抑制率可达到80%以上，鉴于染料木素是大豆源提取而得，因此，在大豆加工和改性过程中，外添加染料木素浓度达到0.10 mmol/L以上，即可以有效抑制有害产物AGEs的形成。这与Kong Yanghui等[36]用染料木素来抑制β-乳球蛋白羰基化生成AGEs，其抑制效果在一定范围内与浓度呈正相关性的实验结果相一致。Jung等[37]通过荧光检测的方法发现染料木素可以阻断AGEs-RAGE的交联，并且随着染料木素剂量的增加，其阻断程度也呈线性增加。目前，国内外研究抑制AGEs生成的机制主要有以下几种：一是通过添加抑制剂来阻断还原糖和蛋白质的接触。二是通过隔绝或者去除中间产物来减弱其糖基化进程；三是采用AGEs断裂剂断裂已经生成的AGEs交联产物[38]。

图5 抑制剂种类和浓度对大豆7S蛋白-糖体系AGEs形成的影响Fig. 5 Effects of inhibitor type and concentration on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

2.6 SDS-PAGE表征大豆7S糖基化过程及染料木素抑制效果

图6 大豆7S蛋白糖基化产物的SDS-PAGE图Fig. 6 SDS-PAGE of soybean 7S globulin glycosylation products

SDS-PAGE分析100 ℃、pH 7.2、蛋白质与葡萄糖质量浓度比例为1∶2条件下大豆7S蛋白糖基化产物随反应时间和抑制剂添加量的变化，结果如图6所示。大豆7S蛋白与葡萄糖反应一定时间后在分离胶与浓缩胶界面有新的条带产生（泳道2～4），表明大豆7S蛋白糖基化产生了大分子质量的聚集物，且由于分子质量太大而难以进入浓缩胶中。当糖基化反应时间从15 min增加到60 min时，浓缩胶与分离胶界面间新条带的颜色进一步加深，分子质量42.7～97.4 kD区域间大豆7S蛋白条带颜色变浅，说明随着反应时间的延长，糖基化反应程度加深，从而促使更多糖基化产物的生成。

在大豆7S蛋白-葡萄糖模型中加入一定量的染料木素，浓缩胶与分离胶界面间新条带的颜色明显变浅几乎消失（泳道5～7），表明糖基化引起交联的高分子质量蛋白含量显著减少，染料木素对大豆7S蛋白糖基化产物有明显的抑制效果。染料木素的添加浓度为0.1 mmol/L时高分子质量蛋白条带已经消失，增加至1.0 mmol/L时变化不明显，表明0.1mmol/L染料木素可有效抑制大豆7S交联大分子的形成，而2.5节结果表明，染料木素浓度的增加对体系AGEs生成量的抑制依然存在明显增大效果。

3 结 论

通过对大豆7S蛋白-糖体系中AGEs形成的考察，表明大豆7S蛋白在糖基化改性过程中会产生荧光性AGEs，并且糖的种类和质量浓度、反应温度、pH值、抑制剂的种类和浓度会对AGEs的产生具有重要的影响。各种糖的反应活性依次为果糖＞葡萄糖＞乳糖＞蔗糖。当反应时间一定时，蛋白质与糖的质量浓度配比（1∶1、1∶2、1∶3和1∶4）越高，反应温度（60、100、121 ℃）越高，AGEs的生成量越多。反应条件在pH 9.2时产生的AGEs明显高于pH 6.5和pH 7.2。此外黄酮类化合物对大豆蛋白糖基化有一定的抑制效果，其中在相同浓度条件下染料木素的抑制效果最好，槲皮素的抑制率与染料木素较为接近，且随着抑制剂浓度的增加，抑制率在不断提高。

因此，在大豆蛋白加工和糖基化改性过程中可以通过采用非还原性糖或分子质量较大的糖，降低蛋白质与糖的质量浓度配比（1∶1左右）和反应温度（100 ℃以内），建立中性偏酸的环境（pH 6.5～7.2）以及添加染料木素或槲皮素等黄酮类抑制剂，从而抑制糖基化反应中AGEs的形成，提高大豆蛋白加工及为大豆食品生产提供一定的理论依据。本研究中食源性黄酮抑制剂的添加可为改善食品安全，降低有害AGEs的产生提供新的思路。

[1] NAKAMYRA S, KOBAVASHI K, KATO A. Role of positive charge of lysozyme in the excellent emulsifying properties of Maillard-type lysozyme-polysaccharide conjugate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42(12): 2688-2691. DOI:10.1021/jf00048a008.

[2] BAYNES J W. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes[J]. Diabetes, 1991, 40(4): 405-412. DOI:10.2337/diab.40.4.405.

[3] GOLDBERG T, CAI W, PEPPA M, et al. Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods[J]. Journal of the American Dietetic Association, 2004, 104(8): 1287-1291. DOI:10.1016/ j.jada.2004.05.214.

[4] VLASSARA H, STRIKER G. Glycotoxins in the diet promote diabetes and diabetic complications[J]. Current Diabetes Reports, 2007, 7(3): 235-241. DOI:10.1007/s11892-007-0037-z.

[5] ZHANG Q B, TANG N, SCHEPMOES A A, et al. Proteomic prof i ling of nonenzymatically glycated proteins in human plasma and erythrocyte membranes[J]. Journal of Proteome Research, 2008, 7(5): 2025-2032. DOI:10.1021/pr700763r.

[6] SIAGH R, BARDEN A, MORI T, et al. Advanced glycation end products: a review[J]. Diabetologia, 2001, 44(2): 129-146. DOI:10.1007/s001250051591.

[7] 叶宽萍, 蔡若男, 孙子林. AGEs与糖尿病肾病[J]. 实用糖尿病杂志, 2010(1): 9-11.

[8] 周娟, 张悦, 陆海英, 等. 晚期糖基化终产物在糖尿病肾病中的病理作用[J]. 生理科学进展, 2009, 40(4): 372-375.

[9] 付四海, 黄久仪. 糖基化终末产物与血管疾病[J]. 国外医学(生理、病理科学与临床分册), 2004, 24(4): 360-362.

[10] 屈琪, 马静. 晚期糖基化终末产物与动脉粥样硬化的研究进展[J].国外医学(卫生学分册), 2008, 35(5): 300-303.

[11] PENG I C, QUASS D W, DAYTON W R, et al. The physicochemical and functional properties of soybean 11S globulin: a review[J]. Cereal Chemistry, 1984, 61(6): 480-489.

[12] 刘顺湖, 周瑞宝, 盖钧镒. 大豆蛋白质11S和7S组分及其亚基分析方法的研究述评[J]. 河南工业大学报(自然科学版), 2007, 28(4): 1-6.

[13] HOU H J, CHANG K C. Structural characteristics of purified β-conglycinin from soybeans stored under four conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(26): 7931-7937.

[14] BIAN Y L, MYERS D J, DIAS K, et al. Functional properties of soy protein fractions produced using a pilot plant-scale process[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2003, 80(6): 545-549. DOI:10.1007/s11746-003-0735-8.

[15] 黄丽华, 麻浩, 王显生, 等. 大豆种子贮藏蛋白11S和7S组分的研究[J].中国油料作物学报, 2003, 25(3): 20-23.

[16] SANG S M, SHAO X, BAI N S, et al. Tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate: a new trapping agent of reactive dicarbonyl species[J]. Chemical Research in Toxicology, 2007, 20(12): 1862-1870. DOI:10.1021/tx700190s.

[17] 孙涛, 李铭, 谢晶, 等. 槲皮素与葛根素对食品体系中非酶糖基化的抑制作用[J]. 食品科学, 2014, 35(3): 47-49. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201403010.

[18] SHAO X, BAI N S, HE K, et al. Apple polyphenols, phloretin and phloridzin: new trapping agents of reactive dicarbonyl species[J]. Chemical Research in Toxicology, 2008, 21(10): 2042-2050. DOI:10.1021/tx800227v.

[19] LÜ L S, SHAO X, CHEN H D, et al. Genistein inhibits advanced glycation end products formation by trapping methylglyoxal[J]. Chemical Research in Toxicology, 2011, 24(4): 579-586. DOI:10.1021/tx100457h.

[20] 李晓明, 邓荣华, 孔阳辉, 等. 芦丁抑制牛血清白蛋白糖基化[J]. 食品科学, 2014, 35(3): 85-89. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201403018.

[21] 张轩. 高蛋白高糖中间水分食品储藏稳定性的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2014: 14-18.

[22] 布冠好, 张楠, 陈复生. 大豆蛋白-木糖复合物的抗原性、致敏性及结构特性研究[J]. 现代食品科技, 2015, 31(11): 33-38.

[23] 王松, 夏秀芳, 黄莉, 等. 湿法糖基化改性对大豆分离蛋白功能性质的影响[J]. 食品科学, 2014, 35(9): 38-42. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201409009.

[24] 管军军. 微波合成大豆蛋白-糖接枝物机理、结构及功能性[D].无锡: 江南大学, 2005: 26-43.

[25] 布冠好, 朱婷伟, 陈复生, 等. 大豆蛋白-乳糖复合物的结构及功能特性研究[J]. 中国粮油学报, 2014, 29(7): 40-44.

[26] 齐军茹, 杨晓泉, 廖劲松, 等. 大豆球蛋白与葡聚糖的干热反应特性[J].中国粮油学报, 2005, 20(6): 79-83.

[27] 徐轲轲. 大豆蛋白与多糖复合物乳化性质的研究[D]. 上海: 复旦大学, 2009: 47-48.

[28] 李冰, 迟玉杰, 鲍志杰, 等. 大豆11S球蛋白-麦芽糖共价改性及其凝胶流变特性[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(7): 39-43.

[29] NAGANO T, HIROTSUKA M. Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(6): 941-944. DOI:10.1021/jf00018a004.

[30] SAHA B C, ZEIKUS J G. Novel highly thermostable pullulanase from thermophiles[J]. Trends in Biotechnology, 1989, 7(9): 234-239. DOI:10.1016/0167-7799(89)90013-9.

[31] SUN Y X, HAYAKAWA S, IZUMORI K. Modif i cation of ovalbumin with a rare ketohexose through the maillard reaction: effect on protein structure and gel properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(5): 1293-1299. DOI:10.1021/jf030428s.

[32] BUNN H F, HIGGINS P J. Reaction of monosaccharides with proteins: possible evolutionary significance[J]. Science, 1981, 213: 222-224. DOI:10.1126/science.12192669.

[33] JING H, KITTS D D. Chemical and biochemical properties of casein: sugar Maillard reaction products[J]. Food and Chemical Toxicology, 2002, 40(7): 1007-1015. DOI:10.1016/S0278-6915(02)00070-4.

[34] 穆利霞, 赵谋明, 颜小平, 等. 超声强化制备大豆蛋白-乳糖接枝物工艺条件的优化[J]. 现代食品科技, 2013, 29(1): 96-101. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2013.01.018.

[35] 肖怀秋, 李玉珍, 林亲录. 美拉德反应及其在食品风味中的应用研究[J]. 中国食品添加剂, 2005(2): 27-30.

[36] KONG Yanghui, LI Xiaoming, ZHENG Tiesong, et al. Glycation of β-lactoglobulin and antiglycation by genistein in different reactive carbonyl model systems[J]. Food Chemistry, 2015, 183: 36-42. DOI:10.1016/J.FOODCHEM.2015.02.122.

[37] JUNG D H, KIM Y S, KIM J S. Screening system of blocking agents of the receptor for advanced glycation endproducts in cells using fl uorescence[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2012, 35(10): 1826-1830. DOI:10.1248/bpb.b12-00361.

[38] VERTOMMEN J, DE LEEUW I. The effect of flavonoid treatment on the glycation and antioxidant status in type 1 diabetic patients[J]. Diabetes, Nutrition & Metabolism, 1999, 12(4): 256-263.

Elucidation of Factors Affecting the Formation of Fluorescent AGEs in Soybean 7S Globulin-Sugar System

LIU Guimei, ZHANG Dingmin, LI Pu, LU Yongling, ZHENG Tiesong, LÜ Lishuang*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Purpose: Non-enzymatic glycation reaction can be induced during the glycosylation modif i cation of soybean 7S protein, which can give rise to the production of harmful advanced glycation end products (AGEs). In order to improve the safety of foods, soybean 7S protein-sugar system was established to fi nd out the factors affecting the formation of AGEs and effectively control the glycosylation reaction under simulated food processing conditions. Methods: The inf l uencing factors including sugar type, sugar concentration, pH, temperature, inhibitor type and inhibitor concentration were detected by fl uorescence spectrometry (λex/λem= 340 nm/465 nm). The formation and inhibition of harmful products were characterized by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Results: The use of fructose as a sugar, a ratio between sugar and protein concentrations of 1:4, a pH value of 9.2, and a reaction temperature of 121 ℃ were the best conditions for the formation of fl uorescent AGEs. The fl avonoids quercetin, genistein, rutin and luteolin could effectively and dose-dependently inhibit the formation of fl uorescent AGEs. Conclusion: The types of sugar and inhibitor have a certain effect on the formation of fl uorescent AGEs. We can inhibit the formation of fl uorescent AGEs by reducing the ratio between sugar and protein concentrations, pH and reaction temperature as well as increasing the concentration of the inhibitor.

soybean 7S globulin-sugar system; glycosylation; fl uorescent advanced glycation end products; fl uorescence spectrometry; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

10.7506/spkx1002-6630-201715004

TS201.2

A

1002-6630（2017）15-0020-06

刘贵梅, 章鼎敏, 李普, 等. 大豆7S蛋白-糖体系晚期糖基化终产物形成因素[J]. 食品科学, 2017, 38(15): 20-25.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715004. http://www.spkx.net.cn

LIU Guimei, ZHANG Dingmin, LI Pu, et al. Elucidation of factors affecting the formation of fl uorescent AGEs in soybean 7S globulin-sugar system[J]. Food Science, 2017, 38(15): 20-25. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715004. http://www.spkx.net.cn

2016-06-01

国家自然科学基金面上项目（31571783）

刘贵梅（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：sunshine6324@126.com

*通信作者：吕丽爽（1969—），女，教授，博士，研究方向为食品化学、功能性食品的分离及活性。E-mail：lishuanglv@126.com