pH调节法制备兔肉分离蛋白及其性质研究

余娱乐，贺稚非,2，李洪军,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆 北碚，400716) 2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 北碚，400716)

生产与科研经验

pH调节法制备兔肉分离蛋白及其性质研究

余娱乐1，贺稚非1,2，李洪军1,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆 北碚，400716) 2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 北碚，400716)

以伊拉兔兔肉为原料，用pH调节法(pH-shifting)提取兔肉分离蛋白，并对分离蛋白的性质进行研究。实验结果表明，pH调节法提取兔肉分离蛋白的最佳酸溶解条件pH 3.0、碱溶解条件pH 12.0、沉淀回收条件pH 5.5。此方法下提取蛋白得率分别为酸法46.46%、碱法68.55%。酸/碱分离蛋白中蛋白质含量(干基)均极显著高于兔肉，脂肪含量(干基)极显著低于兔肉，蛋白所含必需氨基酸比例均衡，且SDS-PAGE电泳分析表示pH调节法提取兔肉分离蛋白并未造成蛋白质严重降解。

pH调节法；兔肉分离蛋白；蛋白质性质

兔肉具有“三高三低”的特点，即高蛋白、高消化率、高赖氨酸、低脂肪、低热量、低胆固醇[1]，营养价值高，不仅肉质鲜美、细嫩，还可预防高血压、肥胖病、动脉硬化等疾病[2]，可满足不同人群的食用需求。但目前兔肉制品类型单一[3]，兔肉虽蛋白质含量高但兔肉蛋白制品的研究和开发却鲜有报道。此外，兔肉中存在的特殊腥味物质在加工过程中不易除去和掩盖，对兔肉的加工和食用均有影响[4]，兔肉深加工和副产品加工还有待发展。

pH调节法(pH-shifting)制备动物分离蛋白最早由HULTIN等[5]提出，即利用蛋白质溶解度随pH值变化的原理，先使蛋白质在极端酸性或碱性条件下充分溶解，再利用蛋白质在等电点溶解度最小使其沉淀析出，从而达到分离蛋白的目的。pH调节法具有提取时间短、回收率高、蛋白变形程度小的特点[6]，根据已有报道，pH调节法已被用于鲤鱼[7]、罗非鱼[6, 8]、鲢鱼[9]、斑节对虾[10]、鸡肉[11]、火鸡[12]以及大豆分离蛋白[13]的制备，但还未见用于兔肉。本实验以兔肉为原料，确定pH调节法制备兔肉分离蛋白的最佳条件，制备分离蛋白，进一步对pH调节法制备的兔肉分离蛋白的性质和氨基酸、蛋白质组成进行研究。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

实验兔购于重庆阿兴记食品有限公司统景养兔场，品种为伊拉兔配套系，70日龄公兔20只，按常规方法击晕放血宰杀，去皮后取背最长肌分装于自封袋中，每只伊拉兔取约140 g背肌，按50 g/袋分装并作好标记，-18℃储藏备用。

牛血清蛋白为生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

UB-7 pH计，德国Sartorius AG公司；电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；722型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；TGL16M型高速冷冻离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；XHF-D 型匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司；L-8900型高速氨基酸分析仪，日本日立公司；小型垂直电泳槽，美国BIO-RAD公司。

1.3实验方法

1.3.1 pH调节法提取兔肉分离蛋白酸溶条件的确定

参照CHOMNAWANG的方法[14]，并稍作修改。称取5 g碎肉，与预冷的去离子水按1∶9(g∶mL)混合后均质处理，每份匀浆用2 mol/L HCl调节pH值分别至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，在4℃条件下浸提3 h并不时搅拌。浸提后匀浆于4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液即得到酸溶解蛋白溶液，蛋白液用100 mL容量瓶定容后用双缩脲法测定上清液中蛋白质含量(标准曲线y=0.042 3x-0.003 6,R2=0.999 6)，并测定各酸溶pH条件下蛋白质溶解度[15]。

1.3.2 pH调节法提取兔肉分离蛋白碱溶条件的确定

参照1.3.1方法，称取5 g伊拉兔背最长肌碎肉，与预冷的去离子水按1∶9(g∶mL)混合后均质处理，每份匀浆用2 mol/L NaOH调节pH值分别至10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5，在4℃条件下浸提3 h并不时搅拌。浸提后匀浆于4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液即得到碱溶解蛋白溶液，蛋白液用100 mL容量瓶定容后用双缩脲法测定上清液中蛋白质含量，并测定各碱溶pH值条件下蛋白质溶解度[15]。

1.3.3 蛋白质回收pH值的确定

将上述最佳酸溶/碱溶条件下得到的蛋白溶液，用2 mol/L HCl或NaOH分别调节pH值至4.5、5.0、5.5、6.0，于4℃、10 000 r/min条件下离心15 min，用双缩脲法分别测定离心后上清液中蛋白质含量，并计算回收率[15]。

1.3.4 兔肉分离蛋白的制备

根据上述实验结果制备兔肉分离蛋白，制备工艺如下：

兔肉碎肉→1∶9 (g∶mL)加入预冷的去离子水并匀浆→调节pH至最佳溶解pH→4℃浸提3 h→10 000 r/min，4℃离心15 min→取上清液调节pH值至最佳回收pH→10 000 r/min，4℃离心15 min→取沉淀，一部分于4 ℃冰箱短期保存备用，一部分冷冻干燥备用

1.3.5 pH调节法提取兔肉分离蛋白提取率计算

(1)

蛋白质含量测定均采用凯氏定氮法。

1.3.6 兔肉分离蛋白基本组成测定

水分测定：直接干燥法GB 5009.3—2010。

粗蛋白测定：凯氏定氮法GB/T 5009.5—2010。

粗脂肪测定：索氏抽提法GB/T5009.6—2003。

灰分测定：灼烧称重法GB 5009.4—2016。

1.3.7 兔肉分离蛋白SDS-PAGE分析

参考JIN[16]方法并根据实验条件稍作修改，将兔肉肌肉匀浆、酸/碱分离蛋白制备成蛋白浓度2 mg/mL的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%，上样量15 μL，采用考马斯亮蓝R-250染色检测。

1.3.8 兔肉分离蛋白氨基酸组成分析

取0.500 g样品于试管中，加入10 mL 6 mol/L HCl后抽真空封管，(110±2)℃烘箱水解22 h，参照国标GB/T5009.124—2003方法进行氨基酸分析。

1.3.9 数据分析

采用Excel 2016进行数据处理，SPSS 19.0进行方差和相关性分析，Orign 8.1绘图。

2 结果与分析

2.1pH调节法提取兔肉分离蛋白最佳条件的确定

2.1.1 最佳酸溶条件的确定

由图1可知，pH变化对肌肉蛋白的溶解度有明显影响，pH为2.0～3.5，兔肉蛋白具有较高的溶解度，均大于80%，在pH 3.0条件下具达到最大溶解度86.97%，由此确定酸法提取兔肉分离蛋白最佳酸溶条件为pH 3.0。

图1 不同酸性pH值条件下兔肉蛋白溶解度变化Fig. 1 Protein solubility of rabbit muscle at acidic pH conditions注：不同小写字母表示结果之间具有显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示极显著差异(P<0.01)。

2.1.2 最佳碱溶条件的确定

图2 不同碱性pH值条件下兔肉蛋白溶解度变化Fig.2 Protein solubility of rabbit muscle at alkaline pH conditions注：不同小写字母表示结果之间具有显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示极显著差异(P<0.01)。

由图2可知，在pH为10.0～12.5时，肌肉蛋白溶解度随pH值升高呈现升高后下降的趋势，pH 10和pH 10.5条件下蛋白溶解度较低，而在pH 12.0时溶解度达到最大为94.77%，由此确定酸法提取兔肉分离蛋白的最佳酸溶条件为pH 3.0。通常蛋白质在碱性条件下的溶解度会大于酸性条件，酸/碱溶最佳pH条件和制备鱼类分离蛋白基本相似[7, 17-18]。

2.1.3 蛋白回收pH值的确定

由图3可看出，无论是酸溶还是碱溶，在pH 4.5～6.0时，兔肉肌肉蛋白均可通过pH调节得到比较高的回收率，蛋白回收率随着pH值的升高先增大后减小，并且在pH 5.5时达到最大值，通常碱溶条件下蛋白的回收率比酸溶更高[7, 19]。

2.2兔肉分离蛋白提取率和基本组成分析

实验结果表明，酸法和碱法提取兔肉分离蛋白的提取率分别为46.46%、68.55%，碱法的提取率高于酸法，和目前鱼贝类研究结果基本一致[7, 19-20]。YULIYA[12]比较酸/碱法提取火鸡分离蛋白得率时发现pH 10.5和pH 11.5条件下蛋白得率均优于pH 3.5，pH 2.5条件下蛋白得率最高但与碱法2个pH条件下的得率并无显著差别。

图3 不同pH值下兔肉蛋白等电点沉淀回收率Fig.3 Protein recovery yields at different pHs during isoelectric precipitation注：不同小写字母表示结果之间具有显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示极显著差异(P<0.01)。

表1为兔肉、酸分离蛋白、碱分离蛋白的基本组成。可以看出，酸/碱分离蛋白的含水量比兔肉高，灰分均显著低于兔肉。但酸/碱分离蛋白的蛋白质含量(干基)均极显著(P<0.01)高于兔肉，其中碱分离蛋白的蛋白含量比酸分离蛋白更高达到87.73%，脂肪含量(干基)均极显著(P<0.01)低于兔肉，属于高蛋白低脂肪的优质蛋白来源。

表1 兔肉及其分离蛋白基本组成 单位：%

注：同一列不同小写字母表示结果之间具有显著差异(P<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(P<0.01)。

2.3兔肉分离蛋白SDS-PAGE分析

泳道从左到右依次为Mark、兔肉肌肉匀浆、酸分离蛋白、碱分离蛋白图4 兔肉分离蛋白SDS-PAGE 图谱Fig.4 SDS-PAGE of the rabbit protein isolate

兔肉肌肉全蛋白以及酸/碱分离蛋白的SDS-PAGE图谱如图4所示。无论是兔肉还是兔肉分离蛋白，蛋白质分子质量分布主要集中在200～100 kDa和45～35 kDa范围内，其中主要有肌球蛋白重链(MHC，210kD)、肌动蛋白(Actin，42 Da)和肌球蛋白轻链(MLC1、MLC2、MLC3，分子量分别为15、17、24 kDa)，在100～45kDa范围内也有明显条带。肌原纤维蛋白由肌球蛋白重链、轻链， 肌动蛋白等构成[21-22]。可以看出，pH调节法能回收大部分蛋白，并且并没有造成蛋白质特别是功能性蛋白如肌原纤维蛋白的严重降解，这也说明pH调节法制备分离蛋白能有效地防止蛋白质水解和变性。

2.4兔肉分离蛋白氨基酸组成分析

由表2可知，兔肉、酸分离蛋白、碱分离蛋白的氨基酸总量(干基)分别为90.007、88.141、95.506 g/100 g。碱分离蛋白的氨基酸总量极显著(P<0.01)高于兔肉和酸分离蛋白，酸分离蛋白中氨基酸总量虽显著低于兔肉(P<0.05)，但在P<0.01水平上差异并不显著，而且并非每种氨基酸都减少。2种分离蛋白的赖氨酸含量均高于兔肉，保留了兔肉高赖氨酸[1]的特点。酸/碱分离蛋白中均含有7中必需氨基酸，分离蛋白WEAA/WTAA均在40%左右，WEAA/WNEAA均高于60%并超过70%，酸分离蛋白和碱分离蛋白的WEAA/WTAA、WEAA/WNEAA均极显著(P<0.01)优于兔肉。根据FAO/WHO理想模式[23]，2种分离蛋白属于氨基酸比例均衡、营养价值高的优质蛋白，pH调节法提取兔肉分离蛋白的过程并未降低兔肉蛋白的营养价值。

表2 兔肉及分离蛋白氨基酸组成(干基)

注：*表示必需氨基酸；同一行不同小写字母表示结果之间具有显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示极显著差异(P<0.01)。

3 结论

由实验结果可知，pH调节法(pH-shifting)提取兔肉分离蛋白的最佳条件为酸溶解pH 3.0、碱溶解pH 12.0，蛋白沉淀回收pH 5.5。在最佳提取条件下，蛋白提取率分别为酸法46.46%、碱法68.55%，碱法的提取效果优于酸法。

pH调节法制得的分离蛋白蛋白含量(干基)分别为酸法76.65%、碱法87.73%，而脂肪含量(干基)只有1.51%和1.53%，蛋白含量极显著(P<0.01)高于兔肉而脂肪含量极显著(P<0.01)低于兔肉。制得的分离蛋白所含必需氨基酸比例均衡，WEAA/WTAA、WEAA/WNEAA均优于FAO/WHO理想模式。酸/碱法提取过程并未导致蛋白质严重降解，并且，碱提蛋白性质优于酸提蛋白。因此，pH调节法可以用于制备兔肉分离蛋白，此法制得的兔肉分离蛋白属于优质蛋白资源，可进一步开发成蛋白产品或用于食品加工。

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RabbitproteinisolatepreparationbypH-shiftinganditproperties

YU Yu-le1,HE Zhi-fei1,2,LI Hong-jun1,2*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China) 2(Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400716, China)

The protein isolate extracted from Ira rabbit meat by pH-shifting method was studied. The result showed that the optimum conditions for acid-soluble and alkali -soluble were pH 3.0 and pH 12.0. The optimum recovery condition was pH 5.5. The yield of rabbit protein isolate were 46.46% by acid method and 68.55% by alkali solution. The protein content (dry basis) of acid method and alkali method were both significantly higher than of rabbit meat, and fat content (dry basis) were both significantly lower than that of rabbit meat. Besides, a variety of essential amino acids of protein isolates were higher than FAO/WHO recommend value. SDS-PAGE pattern indicated no obvious protein degradation was found in the protein isolates extracted by pH-shifting method.

pH-shifting; rabbit protein isolate; protein properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013645

硕士研究生(李洪军教授为通讯作者，E-mail：983362225@qq.com)。

国家自然科学基金项目(31671787)；国家现代农业(兔)产业技术体系建设专项(CARS-44-D-1)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201303144)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(cstc2014pt-gc8001)

2016-12-20，改回日期：2017-01-17