酱油挥发性成分固相微萃取条件的优化

刘非，杜丽平，肖冬光

(天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

酱油挥发性成分固相微萃取条件的优化

刘非，杜丽平，肖冬光

(天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)是提取挥发性成分比较常用的方法。为了确定提取酱油挥发性成分的SPME萃取头，分别以挥发性成分的累积峰面积标准化值和峰面积相对标准偏差的平均值与标准偏差为指标，考察了不同型号萃取头的萃取灵敏度和重复性，确定采用65μm PDMS/DVB提取酱油挥发性成分；并以各类挥发性成分峰面积和总峰面积为指标，优化了其萃取条件，确定萃取条件为：样品用量8 mL，萃取温度60 ℃，萃取时间60 min。利用优化方法对酱油挥发性成分进行提取，经气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析，共鉴定出86种挥发性成分，其中最主要的为酯类物质，其次为醇类、醛类和酸类。挥发性成分峰面积的平均相对标准偏差为8.14%，方法重复性较好。

顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)；酱油；挥发性成分；灵敏度；重复性；优化

酱油主要是以大豆、小麦等为原料，通过微生物的发酵作用，形成具有特殊色泽、香气、味道和状态的调味品[1]。酱油中含有多种挥发性成分，包括醇类、酯类、酸类、酮类、醛类和酚类等，这些成分虽然含量很少，但对其风味有很大影响[2]。若对酱油挥发性成分进行分析，首先应将成分提取出来。由于其挥发性成分复杂、含量低，只有选择合适的提取方法，才能够全面、正确地反映出酱油挥发性成分的组成。目前，常用的酱油挥发性成分提取方法主要为液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)[3]，液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)[4]，同时蒸馏萃取(simultaneous distillation-extraction, SDE)[5]， 热脱附[6]和固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)[7-8]等。与其他提取方法相比，SPME具有操作简单、无需溶剂、提取效果好、变异系数小、低样品用量等优点[9]，在挥发性成分的分析中被广泛应用，其中SPME萃取头是影响挥发性成分提取的重要因素，目前常用的萃取头包括：100 μm PDMS、85 μmPA、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/PDMS/CAR等型号，研究者多以挥发性成分的总峰面积或总峰面积和种类数为指标，分析不同型号萃取头对酱油挥发性成分的萃取效果，然后选取萃取头，但研究结果有一定差异。刘贞诚[10]等采用100 μm PDMS和65 μm PDMS/DVB对酱油挥发性成分进行萃取，结合GC-MS分析，结果显示：65 μm PDMS/DVB萃取效果更佳；陈敏[11]等利用85 μm PA、75 μm CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB分别萃取酱油挥发性成分，经GC-MS分析，其中75 μm CAR/PDMS的萃取效果较佳。YAN[12]等选用以上5种型号萃取头分别萃取酱油挥发性成分，通过GC-MS分析，确定85 μm PA为较适萃取头。在研究SPME萃取头对挥发性成分萃取效果方面，通过对比考察不同型号萃取头对挥发性成分的萃取灵敏度和重复性，可以更全面客观地了解到不同型号萃取头对各挥发性成分的萃取效果[13-15]。本研究先通过考察不同型号SPME萃取头对酱油挥发性成分的萃取灵敏度和重复性，选取萃取头，并以各类挥发性成分峰面积和总面积为指标，优化了酱油用量、萃取温度和时间等萃取条件，为酱油挥发性成分的分析奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

市售生抽酱油(产于广东省佛山市)；正构烷烃混标(C8-C40，色谱纯，上海Sigma-Aldrich公司)；NaCl(分析纯，天津市化学试剂一厂)。

1.2仪器与设备

IT-09A5磁力搅拌器，上海一恒科学仪器有限公司；固相微萃取装置(SPME手柄、100 μmPDMS、85 μmPA、75 μmCAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/PDMS/CAR萃取头)，美国Supelco公司；7890A-5975C GC-MS联用仪、HP-5MS石英毛细管柱(60 m×320 μm×0.25 μm)，美国安捷伦公司。

1.3实验方法

1.3.1 挥发性成分的萃取

取8 mL酱油至20 mL顶空瓶中，加3 g NaCl，立即密封顶空瓶。将样品瓶置于60 ℃水浴中平衡10 min，插入装有纤维头的手动进样器，萃取50 min后，取出萃取头插入GC进样口中于250 ℃解吸附5 min。

1.3.2 萃取头灵敏度和重复性的评价

各类挥发性成分的萃取灵敏度以累积峰面积标准化值(cumulative area normalization value, CANV)为考察指标进行评价[13]，计算方法如下：

AVK= [AK (PDMS)+ AK (PA)+AK (CAR/PDMS)+AK (PDMS/DVB)+AK (DVB/PDMS/CAR)]/5

(1)

NAK(X)= AK(X)/AVK

(2)

(3)

式中：AK(X)为萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积绝对值；AVK为5种萃取头萃取到挥发性成分“K”的峰面积平均值；NAK(X)为萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积标准化值；CAK(X)为萃取头“X”萃取到的一类挥发性成分中1～K个成分的累积峰面积标准化值。

选取能被不同型号萃取头都萃取分析的挥发性成分，然后通过这些成分的绝对峰面积相对标准偏差的平均值和标准偏差对各萃取头进行重复性评价。

1.3.3 HS-SPME萃取头的选择

按照1.2.1方法，分别采用5种型号萃取头进行挥发性成分的萃取(每种萃取头做5个平行)，对比考察不同型号萃取头的灵敏度和重复性，选取二者均较佳的萃取头，进行下一步实验。

1.3.4 萃取条件优化

确定萃取头后，对酱油用量(4、6、8和10 mL)、萃取温度(40、50、60、70 和 80 ℃)和萃取时间(30、40、50、60和70 min)等条件进行优化。

1.3.5 GC-MS分析条件

GC条件：进样口温度250 ℃，不分流模式；载气为高纯氦气(>99.999 9%)，流速1 mL/min； HP-5MS(60 m×320 μm×0.25 μm)石英毛细管柱的升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃ /min升到120 ℃，保持2 min，然后以7 ℃ /min升到230 ℃，保持10 min。

MS条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV；连接口温度：280 ℃：质量扫描范围30～500 amu。

1.3.6 定性方法

挥发性成分经NIST08标准谱库(检索结果匹配度大于等于80%)和保留指数对比进行鉴定。

2 结果与分析

2.1萃取头的选择

2.1.1 不同型号萃取头灵敏度的比较

5种型号萃取头萃取到的酱油挥发性成分经GC-MS分析，共鉴定出醇类、酸类、酯类、醛类、酮类、呋喃类、酚类、碳氢类(即烃类)、含氮类和含硫类等10类成分，而不同型号萃取头对酱油各类挥发性成分表现出明显不同的萃取效果。先以各类挥发性成分的累积峰面积标准化(CANV)值为指标，比较不同型号萃取头对各类挥发性成分的萃取灵敏度。由图1可知， 65 μm PDMS/DVB几乎对每一种成分都显示出较高的NAK值，对每一类成分显示较高的CANV值，说明其对各类挥发性成分均有很强的萃取灵敏度。与65 μm PDMS/DVB相比，50/30 μm DVB/PDMS/CAR和75 μm CAR/PDMS对各类挥发性成分的萃取灵敏度较低。而85 μm PA和100 μm PDMS对各类挥发性成分都显示出了很低的萃取灵敏度，故不再对二者进行重复性考察。

图1 五种萃取头萃取酱油各类挥发性成分累积峰面积标准化值Fig.1 The CANV for different catagories of soy sauce volatile compounds extracted by five fibers

2.1.2 不同型号萃取头重复性的比较

65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/PDMS/CAR和75 μm CAR/PDMS三种萃取头都萃取到的挥发性成分为60种，通过比较这些成分绝对峰面积相对标准偏差(RSD)的平均值和标准偏差，对萃取头的重复性进行评价。RSD平均值和RSD标准偏差如图2所示。经比较显示，65 μm PDMS/DVB的RSD平均值和RSD标准偏差均最小，表现出较好的重复性。

图2 三种萃取头萃取挥发性成分的RSD平均值和RSD标准偏差Fig.2 Average and standard deviation of RSD of volatile compounds extracted by three fibers

根据不同型号萃取头灵敏度和重复性的比较结果，选取65μm PDMS/DVB为萃取酱油挥发性成分的萃取头。酱油挥发性成分分析不仅与萃取头有关，可能与所采用的色谱柱也有很大关系，刘贞诚[10]等利用非极性色谱柱DB-5MS，以挥发性成分的总峰面积为指标，比较了100μm PDMS和65μm PDMS/DVB的萃取效果，65μm PDMS/DVB表现了更佳的萃取效果；陈敏[11]等利用中极性色谱柱DB-17MS，通过比较85μm PA、75μm CAR/PDMS和65μm PDMS/DVB等3种型号萃取头萃取的挥发性成分总峰面积和种类数，选取75μm CAR/PDMS为萃取酱油挥发性成分的萃取头；YAN[12]等采用极性色谱柱DB-WAX，以挥发性成分的总峰面积和种类数为指标，考察了5种与本实验型号相同的萃取头对酱油挥发性成分的萃取效果，经比较分析，选用85μm PA作为实验用萃取头。由此可见，不同极性色谱柱对挥发性成分的分析效果存在差异，使同一萃取头提取物呈现不同的分析结果，影响实验结果。此外，不同酱油样品中挥发性成分组成不同，则萃取头上的竞争性吸附发生在不同组分之间，影响萃取头的选择。

2.2萃取条件优化

由图3可知，随着酱油用量的增加，各类挥发性成分的峰面积不断升高，当酱油用量达到8 mL时，它们的峰面积及总峰面积达到最高值，随酱油用量继续增加，它们的峰面积及总峰面积均降低。萃取温度的升高使各类挥发性成分的峰面积逐渐升高，当萃取温度为60 ℃时，除酚类外，其他各类成分的峰面积及总峰面积均达到最高值，而酚类的峰面积在70 ℃达到最大，随着温度的继续升高，各类成分的峰面积以及总峰面积呈现逐渐降低的趋势。各类挥发性成分的峰面积随着萃取时间的增加而升高，当萃取时间为60 min时，它们的峰面积及总峰面积均达到最高，当萃取时间超过60 min时，它们的峰面积及总峰面积明显降低。综合考虑，确定萃取条件为酱油用量8 mL，萃取温度60 ℃和萃取时间60 min。

图3 酱油用量、萃取温度和时间对酱油挥发性成分萃取的影响Fig. 3 Effect ofthe volume of soy sauce, temperature and time on the extraction of volatile compounds of soy sauce

2.3方法重复性实验

采用优化HS-SPME方法对酱油样品挥发性成分进行提取，然后经GC-MS分析，总离子流色谱图如图4，挥发性成分绝对峰面积的相对标准偏差为0.34%～14.49%，平均值为8.14%，具有较好的重复性，并通过NIST08标准谱库图谱和保留指数定性，共鉴定出86种挥发性成分，结果如表1。

图4 酱油样品挥发性成分总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of volatile compounds of soy sauce sample

表1 酱油样品挥发性成分HS-SPME-GC-MS分析结果

续表1

注：RIexp为测得的保留指数；RIlit为标准谱库文献和参考文献[4, 7, 9, 16]中的保留指数；RSD为3个平行实验挥发性成分绝对峰面积的相对标准偏差。

由表1可知，所分析酱油样品的挥发性成分包括酯类、酸类、醛类、酮类、呋喃类、酚类、含硫类、碳氢类、含氮类和醇类等物质。酯类、醇类、醛类和酸类的含量较高，相对含量分别为36.35%、19.95%、14.61%和13.67%，而其他6类挥发性成分的含量均相对较低，为0.6%～4.32%。在样品挥发性成分中，乙酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙醇、2-甲基丁醛、2-苯基丙烯醛、癸醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、苯乙醛、壬醛、苯甲酸、异辛酸、乙酸和4-乙基愈创木酚的相对含量均高于1%，为样品中主要的挥发性成分。其他相关文献报道中，乙酸乙酯、乙醇、苯甲酸、2-甲基丁醛、乙酸、苯乙醛和4-乙基愈创木酚等也被确认为酱油中主要的挥发性成分[3, 7, 11, 16]。

3 结论

不同型号SPME萃取头对酱油挥发性成分的萃取灵敏度和重复性具有明显差异，即萃取效果明显不同，其中65μ mPDMS/DVB的萃取效果最好；并通过条件优化，确定其萃取条件为：样品用量8 mL，萃取温度60 ℃，萃取时间60 min。采用优化的HS-SPME方法对酱油样品挥发性成分进行提取，经GC-MS分析，共鉴定出86种挥发性成分，且挥发性成分峰面积的平均相对标准偏差为8.14%，有较好的重复性。

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Optimizationofextractionconditionsforvolatilecompoundsinsoysaucebysolid-phasemicroextraction

LIU Fei, DU Li-ping*, XIAO Dong-guang

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) was commonly used for the extraction of volatile compounds. To determine the SPME fiber to extract volatile compounds in soy sauce, the sensitivity of different fibers were examined on the basis of cumulative area normalization value, and their repeatability were examined by the average value and standard deviation of relative standard deviation(RSD) of peak area.65μm PDMS/DVB was then selected to extract volatile compounds in soy sauce. By comparing the peak area of all kinds of volatiles and the total peak area, the extraction conditions were optimized, and the extraction conditions were established as follows: the volume of soy sauce sample was 8 mL, extraction temperature was 60 °C and extraction time was 60 min. Using the optimized method for the extraction of volatile compounds in soy sauce, a total of 86 compounds were identified by GC-MS, wherein the main compounds were esters and followed by alcohols, aldehydes and acids. The average RSD of the peak area of compounds was 8.14%, which showed that the repeatability of the method was well.

headspace solid-phase microextraction; soy sauce; volatile compounds; sensitivity; repeatability; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013834

硕士研究生(杜丽平副教授为通讯作者,E-mail:dlp123@tust.edu.cn)。

国家重点研发计划项目(2016YFD0400505)

2017-01-18，改回日期：2017-05-03