1-磷酸鞘氨醇(S1P)在心室重塑过程中对梗死区血流恢复及血管新生的作用研究

祖丽比娅·艾萨,廖光冲，姜述斌

1-磷酸鞘氨醇(S1P)在心室重塑过程中对梗死区血流恢复及血管新生的作用研究

祖丽比娅·艾萨1,廖光冲2a，姜述斌2b*

目的 观察不同时间周期大鼠心肌梗死模型心肌组织中1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体在梗死区的基因表达情况，探讨其在心肌梗死后心室重塑过程中对梗死区血流恢复及血管新生的作用。方法 采用结扎左冠状动脉前降支(LAD)的方法，造成大鼠左室大面积心梗，建立大鼠心肌梗死模型，分别于术后6、12、24 h观察心肌梗死后心室重塑过程中血流的变化情况。然后处死大鼠，取其心肌组织，提取组织中的RNA，采用实时定量荧光技术(PCR)测定心肌组织中S1P受体mRNA在梗死区的表达情况。结果 术后6 h，大鼠心肌血流量和心肌微血管壁通透性随时间节点的增加均明显降低；术后12 h，这种趋势趋缓。术后6 h，S1P1受体mRNA的表达水平呈明显下降趋势；与对照组相比，结扎梗死大鼠梗死区的S1P2受体mRNA在术后各时间节点表达水平均明显下降。术后6 h，结扎梗死大鼠梗死区的S1P3受体mRNA表达显著增强，但术后12 h出现较为明显的表达抑制现象。结论 大鼠心肌梗死后的心肌血流恢复和新生血管早期可能与S1P1受体mRNA下调有关，随后与S1P2受体mRNA、S1P3受体mRNA逐渐上调有关。

S1P受体；梗死区；血流变化；mRNA表达

0 引言

心室重塑是心肌梗死过程中心力衰竭的中心环节，具有心脏间质纤维化的重要病理特征。传统心室重塑概念认为心室重塑是非梗死区心肌组织的变化，并由急性心梗转为慢性心衰的过程。近年来，随着心力衰竭机制研究的深入，以及干细胞、组织工程等新技术在临床医学方面的应用，心室重塑被赋予了更为广泛的概念，其还包含了梗死区心肌组织的变化。

1-磷酸鞘氨醇(S1P)是细胞膜鞘磷脂代谢过程中产生的一类中间产物，广泛表达于各类细胞组织中，如主要表达于内皮细胞的S1P1、S1P2受体和主要表达于平滑肌细胞的S1P2、S1P3受体[1-2]。血管平滑肌细胞和内皮细胞对心室重塑阶段血流恢复和新生血管具有重要的影响[3]。传统S1P在心肌疾病方面的应用多集中在非梗死区心室重塑方面，对S1P在梗死区心室重塑方面的研究较少[4]。实时荧光定量PCR检测技术可以通过测定聚合酶链式反应(PCR)循环后的产物总量，对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。本文通过实时荧光定量PCR检测技术和血流分析技术检测不同S1P系列在梗死区对心室重塑表达水平及血流变化情况的影响，探讨心室重塑阶段相关S1P在梗死区对心肌血流的作用，以期为心肌梗死病理性疾病的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 选取健康成年雄性SD大鼠(220～250 g)40只(新疆军事医学科学院实验动物中心提供)，动物许可编号：XJSCXK-(军)2015-0753。实时定量PCR试剂盒、静脉注射水合氯醛液由上海研卉生物科技有限公司提供；S1P1、S1P2、S1P3系列引物由美国Takaral公司提供。

动物呼吸机SA926-ALC-V8D，由北京中西集团有限公司提供；高通量组织细胞研磨破碎仪TL2020，由鼎昊源科技有限公司提供；PCR专用工作台，由美国Biocap公司提供；荧光定量PCR仪SLAN2565，购于上海宏石医疗科技有限公司；酶标仪M362275，由西化仪(北京)科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物心肌梗死心室重塑模型的建立 采用结扎左冠状动脉前降支(LAD)的方法，造成大鼠左室大面积心梗。以0.5%戊巴比妥钠对大鼠腹腔予以注射麻醉，切开气管，将动物呼吸辅助机连接到气管处，无菌条件下在胸骨左侧，沿胸骨平行方向做长2～3 cm的纵切口，依次切开皮肤和胸大肌，凸出肋骨部分。钝性分离五、六肋间的肋间肌，采用开胸器扩开胸腔，暴露出心脏部分，挤压出心脏，于LAD根部约2 mm处连同心肌进行结扎。然后小心将心脏放回胸腔。操作完成后，缓慢加大通气量，当大鼠左肺充分膨胀后，逐层关闭胸腔，使其完全闭合，然后在胸廓两侧缓缓施压，挤掉胸腔内的空气，当观察到大鼠出现自主呼吸症状时，撤除呼吸辅助系统。对照组：仅打开大鼠胸腔，暴露出心脏后，不参与结扎手术。术后按每组4只给予大鼠保温饲养，持续3 d，以15万 U/d对大鼠注射青霉素。术后1 h内进行心功能测试，以验证大鼠心肌梗死心室重塑模型是否造模成功。采取尾静脉静推法，注射10%氯化钾溶液处死10组大鼠。开胸，挤出心脏，以0～4 ℃的PBS溶液灌洗心腔，滤干后剪去心底部血管和梗死交界区组织(附近约2 mm)，左室梗死区和非梗死区心肌组织分离后，将其在液氮中迅速冷冻5 s，最后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 心功能测定 以0.4%浓度戊巴比妥钠将结扎10 min后的大鼠麻醉，分别在右侧颈总动脉处和左心室插入测压导管，并连接多导生理仪，依次测定外周平均动脉压、左心室舒张末期压、上升/下降的最大速率(左室内压)、左心室收缩压。

1.2.3 梗死区心肌血管变化检测 采用文献[2]方法以TTC对大鼠心肌梗死模型梗死区进行染色，以放射性生物微球法检测局部心肌血流变化情况。心肌微血管壁通透性测定：将各组心肌组织剪碎后，室温下置于甲酰胺溶液中浸泡2 d，离析得到的上清液于分光光度计比色，参考比色波长620 nm，测定各组心肌组织的光密度值(OD)。分别在大鼠结扎梗死后6、12、24 h测定血流和心肌微血管壁通透性，并与对照组进行比较。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 以异硫氰酸弧法[5]，将各组心肌组织分别用0.01 mol/L的PBS溶液处理后，切碎，置于Trizol试剂进行匀浆10 min，然后将浆液离心后，加入异丙酮溶液,在室温下继续孵育15 min，当上下分层后，弃去上清液，用70%乙醇对下方沉淀块进行冲洗后，加入DEPC水50 μL溶解，得到RNA溶液。以分光光度计测定其浓度后置于-80 ℃保存备用。取50 μL上述溶液，依次加入总RNA物质5 μg，缓冲液10 μL(10 mmol/L)、RNasin溶液0.5 μL、Oligo物质0.25 μg，反转录酶(M-MLV)溶液3 μL、DTT溶液0.5 μL(0.1 mol/L)后，37 ℃孵育1 h，然后在65 ℃下继续反应5 min，最后得到反转录cDNA，置于-20 ℃下保存，以GAPDH基因标准化为参照测定各组mRNA表达水平。

1.2.5 Western蛋白检测心肌HSP70蛋白表达水平 将各组心肌组织分别用0.01 mol/L的PBS溶液处理后，加入10 μL裂解液冰浴处理15 min，采用细胞刮取少许细胞于EP试管中，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心2 min。取上清液与缓冲液按照5∶1体积比混匀后在100 ℃条件下变性5 min，离心后，置于-20 ℃冷冻保存。再通过电泳、转膜、显色后采用Image软件对显色条带灰度值精细分析，通过与β-actin灰度值比较，得到心肌HSP70蛋白表达水平。

2 结果

2.1 大鼠结扎后心功能测试结果 结扎手术结束后存活38只。与对照组相比，结扎组大鼠的左心室舒张末期压、外周平均动脉压、左心室收缩压、左室内压上升速率明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功。见表1。

2.2 梗死区心肌血管变化检测结果 大鼠冠状动脉结扎后，与对照组相比，梗死区心肌血流量在各时间节点均明显减少(P<0.01)，血流量在结扎12 h时达到最低，之后呈增加趋势。见表2。

2.3 梗死区心肌血管变化检测结果 大鼠冠状动脉结扎后，与对照组相比，各结扎组大鼠梗死区心肌微血管壁通透性在各时间节点均明显减少(P<0.01)，微血管壁通透性在结扎12 h时达到最低，之后呈增加趋势。见表2。

表1 大鼠结扎后心功能测试结果

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

表2 大鼠结扎后梗死区心肌血流量、微血管壁通透性变化

注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

2.4 大鼠心肌mRNA表达情况 与对照组相比，结扎组大鼠梗死区S1P1 mRNA在各时间节点的表达水平均明显下降(P<0.05)；结扎梗死12 h后，S1P1 mRNA的表达水平下降幅度趋稳。与对照组相比，结扎组大鼠梗死区S1P2 mRNA在各时间点的表达水平均明显下降(P<0.01)，在结扎梗死12 h时的表达水平达到最低，在结扎梗死24 h的表达开始有所回升。与对照组相比，结扎6 h后大鼠梗死区S1P3 mRNA表达水平出现显著上调(P<0.01)，结扎12 h与24 h后，大鼠梗死区S1P3 mRNA表达水平呈现不同程度的表达抑制现象，结扎24 h后，大鼠梗死区S1P3 mRNA表达水平明显低于结扎6 h、12 h后及对照组(P<0.01)。见图1。

2.5 大鼠心肌HSP70蛋白表达水平 加入不同S1P 6 h后，各组蛋白表达均明显增强，S1P3对心肌HSP70蛋白表达的作用最强(P<0.01)，而S1P1最弱(P<0.01)。见图2。

3 讨论

本研究表明，心肌梗死后，心肌血流微循环无论是在代谢、形状还是功能上均出现一系列变化。心肌梗死6 h后，血流量明显减少，只有正常的3%，同时，梗死区心肌微血管壁通透性明显增加，心肌微血管壁通透性只有正常的83.7%。

图1 术后各组大鼠梗死区mRNA表达水平

S1P是细胞膜鞘磷脂代谢过程中产生的一类中间产物，广泛表达于各类细胞组织中，目前包括8个成员，分别是S1P1(EDG1)、S1P2(EDG2)、S1P3(EDG3)、S1P4(EDG4)、S1P5(EDG5)、S1P6(EDG6)、S1P7(EDG7)、S1P8(EDG8)，其中，关于S1P1、S1P2、S1P3的研究最多，也最为重要。最新的研究成果显示，S1P1、S1P2、S1P3通过与膜表面特异的G蛋白结合，对血流恢复和毛细血管结构重塑具有非常重要的作用[5-6]。本实验采用实时荧光定量PCR检测技术，分别检测了心肌梗死后重塑阶段S1P1、S1P2、S1P3在梗死区不同时间节点的表达情况，结果表明，大鼠心肌梗死后，梗死区S1P1、S1P2、S1P3 mRNA均降低，同时血流量与心肌微血管壁通透性明显改变，说明S1P1、S1P2、S1P3在心肌梗死后对梗死区血流量与心肌微血管壁通透性有显著影响，但对不同S1P的影响不同[7]。

大鼠心肌梗死6 h后，梗死区S1P1、S1P2显著降低，S1P1、S1P2受体表达通过激发释放胞浆，促进细胞分裂和DNA合成，提高血管内皮细胞增殖和抗凋亡能力，由于S1P1、S1P2受体降低，细胞增殖能力降低，血管新生减慢，从而导致血管壁通透性降低[8]；心肌梗死12 h后，S1P1的下降趋稳，S1P2出现一定程度的升高，而血流量与心肌微血管壁通透性也有所增加，说明由于血管新生能力得到恢复，相应提高了血管的血流量，增加了心肌微血管壁的通透性，二者之间有一定的正相关关系[9]。大鼠心肌梗死6 h后，梗死区S1P3显著上调，但12 h后，呈现出不同程度的表达抑制现象，S1P3受体主要表达于血管平滑肌细胞，其不能迁移至毛细血管附近而加强血管结构，导致血管发育受限。大鼠心肌梗死6 h后，S1P3受体表达显著上升，细胞迁移受限，心肌微血管壁出现相应的负相关关系。大鼠心肌梗死12 h后，这种作用趋缓，心肌血流量、微血管壁也出现了一定的恢复，S1P3受体影响减弱。

基于以上分析，我们推测：在心室重塑过程中，S1P1信号减弱，梗死早期增强心肌S1P1信号对于心肌细胞新生、改善心功能有益[10]。心肌梗死后，给予S1P1受体选择性激动剂SEW2871，可能对促进梗死区心肌细胞新生和凋亡减少，增强心肌功能有一定帮助[11]。S1P2对细胞迁移以及增强和维护内皮细胞功能具有明显的作用，给予S1P2受体拮抗剂，如JTE-013，对心力衰竭相关肌源反应的消除具有积极作用[12]。S1P2在心肌梗死早期表达并不显著[13]。S1P3受体主要表达于血管平滑肌细胞，不能迁移至毛细血管附近加强血管结构，对心肌纤维化过程不能起到积极作用，伴随其表达抑制，心肌出现一定的“自救”现象[14]。

有研究表明，HSP70蛋白表达与心肌细胞凋亡密切相关，通过加入不同S1P干预HSP70蛋白表达，可以测定不同S1P在HSP70蛋白表达中的水平。本研究表明，不同S1P均对心肌梗死造成的心肌细胞凋亡具有显著的保护作用，作为机体内源性保护蛋白，在S1P作用后，HSP70表达量增加，但不同S1P对心肌HSP70蛋白表达不一致，S1P3对心肌HSP70蛋白表达水平最高，而S1P1表达低于S1P2、S1P3，因此，在促进梗死区心肌细胞新生和凋亡减少、增强心肌功能方面，加入S1P对增强HSP70蛋白表达、提高心肌细胞自身修复具有积极作用。目前，对于心室重塑过程中S1P受体在心肌梗死区，特别是S1P1、S1P2、S1P3 mRNA变化趋势对于梗死区心肌组织影响的报道较少。本文期望通过探讨心室重塑阶段相关S1P在梗死区对心肌血流及心肌微血管壁作用的影响，以期为心肌梗死病理性疾病治疗提供更多的理论依据。

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Role of sphingosine-1-phosphate (S1P) on the recovery of blood flow and angiogenesis in the infarcted area during ventricular remodeling

ZULIBIYA Aisa1，LIAO Guang-chong2a,JIANG Shu-bin2b*

(1.The Fourth Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China;2.a ICU,b.CCU,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China)

Objective To observe the gene expression of sphingosine-1-phosphate (S1P) receptors in myocardial tissues after myocardial infarction in rats,and to explore its effect on the recovery of blood flow and angiogenesis during ventricular remodeling after myocardial infarction.Methods Ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) was used to cause large area of myocardial infarction in rats′s left ventricule,so as to establish a rat model of myocardial infarction.The change in blood flow during the myocardial infarctio ventricular remodeling process was observed at 6 h,12 h and 24 h after operation.The rats were killed,and the RNA in myocardial tissue was extracted.The expression of S1P receptor mRNA in myocardial tissue in the infarcted area was detected by using real-time quantitative RNA technology (PCR).Results The myocardial blood flow and the permeability of myocardial microvascular wall decreased at 6 h after operation.At 12 h after operation,the decreased tendency was slowed down.The expression level of S1P1 receptor mRNA decreased obviously in the infarcted area at 6 h after operation.Compared with normal group,the expression of S1P2 receptor mRNA decreased at each time point after operation.The expression of S1P3 receptor mRNA was significantly enhanced in the infarcted area at 6 h after operation,but it was inhibited at 12 h after operation.Conclusion The recovery of myocardial blood flow and angiogenesis may be related to down-regulating the expression of S1P1 receptor mRNA in the early stage of myocardial infarction in rats,and up-regulating the expression of S1P2 receptor mRNA and S1P3 receptor mRNA gradually in the later stage.

Sphingosine-1-phosphate receptors;Infarct area;Blood flow changes;mRNA expression

2016-12-01

1.新疆医科大学第四附属中医院，乌鲁木齐 830000;2.新疆维吾尔自治区中医医院 a.ICU,b.CCU,乌鲁木齐 830000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708013