齐墩果酸通过VEGF-Src通路对蛛网膜下腔出血大鼠模型血管内皮紧密连接表达的影响

韩雨薇，刘秀娟，高 阳，李晓明

·论著·

齐墩果酸通过VEGF-Src通路对蛛网膜下腔出血大鼠模型血管内皮紧密连接表达的影响

韩雨薇，刘秀娟，高 阳，李晓明*

目的 探讨齐墩果酸对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的保护作用，阐释其可能的机制。方法 54只成年雄性SD大鼠分成3组(假手术组、SAH模型组、齐墩果酸给药组)，每组18只。采用颈内动脉穿刺法建立大鼠SAH模型，造模1 h后给药，24 h后进行神经功能损伤评分；检测脑水含量及脑伊文思蓝浸出；并利用Western blot方法检测脑组织Src、VEGF、ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表达量。结果 齐墩果酸高剂量给药可有效改善神经功能损伤(P<0.01)；降低脑组织含水量和脑血管通透性(P<0.01)；增加ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表达，降低VEGF水平，抑制Src激活(P<0.05)。结论 齐墩果酸对SAH后早期脑损伤有显著的保护作用，可改善脑水肿，其作用机制可能与增加脑组织紧密连接蛋白的表达有关。

齐墩果酸；蛛网膜下腔出血；脑水肿；紧密连接

0 引言

维持血管屏障功能的关键在于内皮细胞之间的相互作用，内皮细胞之间通过紧密连接结构结合在一起调控血管通透性[7]。BBB紧密连接结构组成主要是由跨膜蛋白Occludin、Claudin及胞质附着蛋白ZO家族组成的复合体。屏障功能的破坏、通透性的改变与细胞间的紧密连接状态密不可分。

齐墩果酸(3b-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid，OA)是广泛存在于食品和药用植物中的五环三萜类化合物，具有多种生物活性，有潜在的抗炎和神经保护作用。本研究采用动脉刺破方法建立SAH模型，考察齐墩果酸在SAH大鼠模型中能否通过改善紧密连接保护屏障功能从而减轻早期脑损伤，探讨其发挥药效的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 药物齐墩果酸购自天津士兰科技有限公司；p-Src和Src抗体购自Cell Signaling Technology公司；VEGF、ZO-1，Claudin-5、Occludin抗体购自Santa Cruz公司；HRP二抗均购自Santa Cruz公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液及5×loading buffer均购自碧云天公司。

1.2 实验动物和分组 雄性清洁级SD大鼠(280～350 g)购自沈阳军区总医院实验动物中心，实验动物合格证号0005095。动物饲养于18～22 ℃恒温室中，12 h/12 h光暗周期，实验前自由进食、水。54只大鼠随机分成3组，每组18只：假手术组、模型组、齐墩果酸给药组(20 mg/kg)。术前禁食，自由饮水，在模型制作完成后1 h给药，24 h后进行取材。

1.3 模型建立 手术前，10%水合氯醛腹腔麻醉，于颈部正中纵向切开后，分离出颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉远端，并以手术线临时阻断颈总动脉和颈内动脉，在颈内动脉端用手术剪刀剪一小口，将鱼线(直径0.261 mm)从小口送入颈内动脉，推进至大鼠大脑前动脉和中动脉分叉处，并穿破动脉建立SAH模型。假手术组中进行类似的操作，但不穿破动脉。

1.4 SAH严重性评价 SAH的严重性根据Sugawara[8]评分标准对SAH血凝块进行0～3级评分。评分越高表示SAH越严重。

1.5 死亡率和神经功能缺失的评价 记录死亡率，并根据Sugawara[8]评分标准对SAH 24 h 后的各组大鼠进行神经功能缺陷评分，即对大鼠自发性活动、四肢运动对称、前肢伸展、攀登、双侧躯干的触碰反应以及触须反应6个项目进行测试，并给予0～3分的评价。各项之和作为总评分，得分越低表明神经功能损伤越严重。平衡木测验：平衡木为长80 cm、宽2.5 cm的方木棒，平放于距地面10 cm处，将大鼠放在平衡木上，能坚持91～120 s计6分，61～90 s计5分，31～60 s计4分，21～30 s计3分，11～20 s计2分，1～10 s计1分，将大鼠放上平衡木会掉下来计0分[9]。

1.6 脑组织含水量测定 每组取6只大鼠，造模24 h后，取出大鼠脑组织，将其切分为左右半脑及小脑三部分，擦去表面血迹分别称量其湿重后，放入110 ℃烘箱内烘干72 h。称量其干重，按照公式计算其脑含水率：脑含水率(%)=(湿重-干重)/湿重]×100%。

1.7 脑血管通透性测定 每组取6只大鼠，于取材前1 h尾静脉给予2%伊文思蓝溶液(5 mL/kg)，全身循环1 h后，进行生理盐水灌注，迅速取出脑组织，将其切分为左右半脑及小脑三部分，即称重。按10 mL/g的体积将组织浸润到甲酰胺溶液中，60 ℃恒温孵育24 h待伊文思蓝浸出，收集浸出液于酶标仪620 nm处测定其OD值。

④遥感技术具有数据稳定、方法科学、手段先进等特点，随着国产自主高分辨率卫星技术的发展以及生态清洁小流域规划审批新工作模式的实践与完善，其在北京市生态清洁小流域建设审批工作中的应用效果也将不断提升，并可进一步向其他生态建设工程的规划评审工作推广。

1.8 Western blot检测蛋白表达 大鼠过量麻醉致死，取大鼠患侧大脑皮层，称重后加入1 mL裂解液(含PMSF)，匀浆裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清即为蛋白溶液；BCA法测定蛋白浓度，按照蛋白溶液体积的1/4加入5×loading buffer混合，100 ℃煮沸5 min，却后-70 ℃保存；用10% SDS-聚丙烯胺凝胶电泳，向加样孔中加入40 μg总蛋白样品，恒流转至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；一抗VEGF和ZO-1、Claudin-5、Occludin的稀释比例为1∶200，Src稀释比例为1∶600，p-Src稀释比例为1∶400，β-actin一抗的稀释比例为1∶1 000，4 ℃过夜；将HRP标记的二抗用TBST稀释，与膜室温孵育1 h；TBST洗后经Pro-light HRP化学发光检测试剂盒发光，用X-ray显影。

2 结果

2.1 齐墩果酸对大鼠SAH分级的影响 如图1所示，SAH模型组蛛网膜下腔出血严重，SAH评分显著降低，而齐墩果酸给药能够减轻SAH出血的发生，降低SAH的评分。

图1 齐墩果酸给药对蛛网膜下腔出血24 h后SAH评分的影响

2.2 齐墩果酸对SAH大鼠神经功能损伤的影响 依照行为学评分标准，分值越低表明神经损伤越严重，反之亦然。与假手术组相比，SAH模型组大鼠均出现了严重的神经损伤症状(P<0.001)。而齐墩果酸给药(20 mg/kg)能够显著改善大鼠的神经功能(P<0.01)。见图2。

图2 齐墩果酸给药对蛛网膜下腔出血24 h后神经功能损伤的影响

2.3 齐墩果酸对SAH大鼠脑水肿和脑血管通透性的影响 与假手术相比，SAH模型组脑含水量明显增加，而齐墩果酸给药组能够显著降低脑含水量(P<0.01)。SAH模型后，伊文思蓝浸出明显增加，说明脑血管通透性增强，齐墩果酸给药降低脑内伊文思蓝含量，对脑血管通透性具有显著的改善作用(P<0.01)。见图3。

图3 齐墩果酸对SAH大鼠脑组织含水量

2.4 齐墩果酸对SAH大鼠VEGF-Src信号通路的影响 如图4所示，SAH组大鼠脑组织中VEGF表达明显增加，而齐墩果酸给药后，VEGF的表达显著降低(P<0.01)。对p-Src和Src的表达进行检测发现，SAH模型组大鼠脑组织Src活化，磷酸化Src表达增加，而齐墩果酸给药组显著抑制Src的磷酸化。

图4 齐墩果酸对SAH大鼠VEGF-Src信号通路的影响

2.5 齐墩果酸对SAH大鼠脑组织黏附连接蛋白表达的影响 如图5所示，与假手术组相比，SAH组ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比，齐墩果酸给药后能够显著恢复这种变化，增加ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表达(P<0.05)。

3 讨论

蛛网膜下腔出血是一种常见的出血性脑血管疾病，多见于动脉瘤的破裂。SAH发生后，可引起一系列的并发症，如脑水肿、脑血管基底动脉痉挛、肺水肿等。其中脑水肿是SAH后较严重的并发症，也是蛛网膜下腔出血患者致死致残、预后差的主要原因之一。齐墩果酸具有多种生物活性，有潜在的抗炎和神经保护作用。本研究采用颅内动脉穿刺法建立大鼠SAH模型，该模型比较接近人类动脉瘤性蛛网膜下腔出血的病理生理过程，但缺点是难以控制出血速度与出血量，由于出血量的不同，SAH的程度不一致，影响实验结果的可靠性。出血量的多少可通过改变尼龙丝尖端直径的大小来控制[10]，本研究采用相同的尼龙线进行实验操作，尽量避免手术差异，并选取SAH损伤程度相近的模型进行实验和统计。本研究结果显示，齐墩果酸对SAH大鼠的神经功能损伤具有显著的改善作用。大鼠SAH后24 h脑含水量和伊文思蓝渗出明显增加，而齐墩果酸给药后，大鼠脑含水量和伊文思蓝渗透率明显降低，说明齐墩果酸能有效减轻SAH引起的脑水肿和脑血管通透性的破坏。

图5 齐墩果酸对SAH大鼠脑组织ZO-1蛋白表达的影响

脑血管内皮屏障主要与脑血管内皮细胞间的通透性相关。紧密连接是维持内皮细胞选择渗透性屏障功能的关键要素，紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5、Occludin是构成紧密连接的重要成分，其表达、功能和结构的改变可引起紧密连接解离，细胞间隙加大，从而增加血管通透性。研究表明，实验性蛛网膜下腔出血可以损伤内皮屏障功能，导致通透性增加，引起组织或器官水肿和功能障碍。并且，大量研究发现，在大鼠SAH模型中，ZO-1、Claudin-5、Occludin表达显著减低，紧密连接破坏，通透性显著增加，加重脑水肿的发生。因而保护屏障功能，降低血管通透性，可能是减轻SAH后早期脑损伤的关键环节之一。血管内皮生长因子(VEGF)是一种多效细胞因子，具有促有丝分裂和通透性相关的多种功能。一些研究已经证明，VEGF的表达上调是实验性SAH后BBB破坏脑水肿形成的发病机制[11]，并且VEGF活化导致Src酪氨酸激酶的磷酸化[12]。Src介导VEGF对BBB通透性的改变，抑制Src可减弱血管通透性，减少脑水肿及缺血性中风后的脑梗死的发生[13-14]。

本研究针对齐墩果酸对SAH后大鼠脑组织中ZO-1、Claudin-5、Occludin的表达变化及可能的作用机制进行了考察，发现假手术组ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白表达明显，在SAH组大鼠脑组织中其表达显著减少，而齐墩果酸(20 mg/kg)可以改善SAH 后大鼠脑组织中ZO-1、Claudin-5、Occludin表达降低的情况，增加其蛋白的表达，进而改善脑水肿，对SAH后早期脑损伤有保护作用。

￣综上所述，齐墩果酸能够减轻SAH后早期脑水肿，并改善神经功能损伤，在SAH后早期脑损伤治疗中有良好的应用前景。本文为齐墩果酸改善SAH早期脑损伤、保护屏障功能、减轻脑水肿的可能的作用机制提供了参考依据，其具体机制仍有待深入研究。

[1] Dority JS,Oldham JS.Subarachnoid hemorrhage:an update[J].Anesthesiol Clin,2016,34(3):577-600.

[3] Fujii M,Yan J,Rolland WB,et al.Early brain injury,an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research[J].Transl Stroke Res,2013,4(4):432-446.

[4] Zhang T,Su J,Guo B,et al.Apigenin protects blood-brain barrier and ameliorates early brain injury by inhibiting TLR4-mediated inflammatory pathway in subarachnoid hemorrhage rats[J].Int Immunopharmacol,2015,28(1):79-87.

[5] Li Z,Liang G,Ma T,et al.Blood-brain barrier permeability change and regulation mechanism after subarachnoid hemorrhage[J].Metab Brain Dis,2015,30(2):597-603.

[6] Zhang C,Lee JY,Keep RF,et al.Brain edema formation and complement activation in a rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl,2013,118:157-161.

[7] Chattopadhyay R,Dyukova E,Singh NK,et al.Vascular endothelial tight junctions and barrier function are disrupted by 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid partly via protein kinase C ε-mediated zona occludens-1 phosphorylation at threonine 770/772[J].J Biol Chem,2014,289(6):3148-3163.

[8] Sugawara T,Ayer R,Jadhav V,et al.A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model[J].J Neurosci Methods,2008,167(2):327-334.

[9] Thal SC,Mebmer K,Schmid-Elsaesser R,et al.Neurological impairment in rats after subarachnoid hemorrhage-a comparison of functional tests[J].J Neurol Sci,2008,268(1-2):150-159.

[10]Schwartz AY,Masago A,Sehba FA,et al.Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat:a refinement of the endovascular filament model[J].J Neurosci Methods,2000,96(2):161-167.

[11]Liu L,Fujimoto M,Kawakita F,et al.Vascular endothelial growth ractor in brain edema formation after subarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl,2016,121:173-177.

[12]Song H,Zheng G,Shen XF,et al.Reduction of brain barrier tight junctional proteins by lead exposure:role of activation of nonreceptor tyrosine kinase src via chaperon GRP78[J].Toxicol Sci,2014,138(2):393-402.

[13]Hu G,Minshall RD.Regulation of transendothelial permeability by Src kinase[J].Microvasc Res,2009,77(1):21-25.

[14]Liu L,Fujimoto M,Kawakita F,et al.Anti-vascular endothelial growth factor treatment suppresses early brain injury after subarachnoid hemorrhage in mice[J].Mol Neurobiol,2016,53(7):4529-4538.

Effect of oleanolic acid on tight junctions of rat model after subarachnoid hemorrhage through VEGF-Src pathway

HAN Yu-wei,LIU Xiu-juan,GAO Yang,LI Xiao-ming*

(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the effect of oleanolic acid (OA) on early brain injury following subarachnoid hemorrhage (SAH) and explain its possible mechanism.Methods Totally 54 male SD rats were divided into 3 groups:sham group (n=18),SAH group (n=18) and OA-treated SAH group (n=18).The endovascular puncture model was used to induce SAH.Neurological score,brain water content and blood-brain barrier (BBB) were evaluated at 24 h after SAH.The protein expression of ZO-1,VEGF and Src was determined by Western blot.Results High-dose OA administration could significantly improve the neurological scores (P<0.01),reduce the brain water content and BBB permeability (P<0.01),up-regulate the expression of ZO-1,Claudin-5 and Occludin,and inhibit the expression of VEGF and Src phosphorylation (P<0.01).Conclusion OA can protect against the early brain injury after SAH and improve brain edema by increasing the expression of tight junctions.

Oleanolic acid;Subarachnoid hemorrhage;Brain edema;Tight junctions

2017-03-10

沈阳军区总医院神经外科，沈阳 110016

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708001