低剂量纳曲酮治疗实验性自身反应性脑脊髓炎的初步研究

王彩玲，徐栩栩，冯 娟

低剂量纳曲酮治疗实验性自身反应性脑脊髓炎的初步研究

王彩玲，徐栩栩，冯 娟*

目的 通过诱导小鼠实验性自身反应性脑脊髓炎(EAE)模型，观察应用低剂量纳曲酮(LDN)干预对EAE发病及炎症反应的影响，从而探究LDN是否对EAE小鼠具有保护作用。方法 选取30只C57小鼠，随机分为3组，即EAE+LDN组、EAE+PBS组及健康对照组，其中，EAE+LDN组在诱导EAE模型后给予0.2 mL的LDN (0.1 mg/kg)腹腔注射，EAE+PBS组在诱导EAE模型后给予等量的PBS腹腔注射，健康对照组为未诱导EAE组。观察各组动物发病情况，每日监测小鼠体重变化，对小鼠进行行为学评分，苏木精-伊红(HE)染色法观察各组小鼠脑组织炎性细胞浸润情况，酶联免疫(ELISA)法监测血清中促炎性细胞因子水平变化。结果 LDN能有效延迟EAE小鼠的发病时间，并显著缓解发病过程中的体重下降及神经功能障碍；HE染色可见LDN干预能有效减轻EAE小鼠脑组织中的炎症反应，并能降低血清中促炎性细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-17水平。结论 LDN能显著缓解EAE模型的发病，并减轻EAE发病过程中的炎性反应。

多发性硬化；实验性自身反应性脑脊髓炎；低剂量纳曲酮；炎性反应

0 引言

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统(脑和脊髓)脱髓鞘和轴突变性为特点的炎性反应性疾病，临床表现包括视力、运动、感觉、植物神经和认知功能的缺损，具有复发、迁延及致残率高等特点，严重影响患者的身心健康[1]。多发性硬化的主要病理改变为神经元丢失，神经胶质增生，脱髓鞘和最终脑萎缩。MS的发病机制主要为CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗原呈递细胞等多种细胞因子，以及趋化因子、免疫球蛋白等共同参与引起的炎症反应。其中，CD4+T淋巴细胞在发病中发挥重要作用[2-3]。研究发现，MS患者及EAE模型体内外周血及脑脊液中存在较高浓度的IL-12、IFN-γ及IL-17，与病情呈正相关，且通过干预上述细胞因子可显著降低动物模型的发病[4-5]。

MS一种潜在的辅助和替代治疗方法为内源性阿片类物质系统，阿片类物质有调节自身免疫性疾病的作用，包括内源性阿片类生长因子及其受体，即甲硫氨酸脑啡肽及其核相关受体。纳曲酮为阿片受体拮抗剂，低剂量纳曲酮(Low-dose naltrexone，LDN)可诱导生成“阿片类物质反弹”现象。研究者认为，LDN可诱导产生一个小的、瞬态的阿片样物质封锁，反馈促进体内内源性阿片物质和阿片受体的上调，可以调节T淋巴细胞、星形胶质细胞和其他与MS炎症及变性相关细胞的复制，从而调控机体的多项效应[6]。以往LDN临床多用于戒毒治疗，最新研究发现，其作为新型抗炎制剂，可显著改善多种炎性疾病，如克罗恩病、纤维肌痛等[7-8]，然而其对MS的研究国内外存在不同的观点，因此，本研究体外给予EAE模型LDN干预，观察LDN对EAE动物模型发病情况及炎症反应的影响。

1 对象与方法

1.1 实验动物及主要试剂 C57小鼠购于北京华阜康实验动物中心，体重15～16 g，适应性喂养1周。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG) 35-55购于上海吉尔生化公司，结核分枝杆菌 H37 Ra株购于DIFCO公司，百日咳毒素(Pertussistoxin，PTX)、完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)及LDN购于Sigma公司。鼠IFN-γ、IL-12、IL-17酶联免疫试剂盒均购于Ebioscience公司。

1.2 EAE模型制备 MOG35-55与等体积的CFA混匀(H37Ra浓度为8 mg/mL)，在冰上充分混匀乳化成油包水状乳剂，然后每只鼠于背部脊柱两旁分4点皮下注入0.2 mL，分别于免疫第0小时及第48小时小鼠腹腔注入PTX 300 ng，建立 EAE小鼠动物模型。免疫当天为第1天。将小鼠随机分为3组：EAE+LDN组、EAE+PBS组、健康对照组。EAE+LDN组、EAE+PBS组均给予EAE造模。EAE+LDN组：从造模第1天即给予0.2 mL的LDN (0.1 mg/kg)腹腔注射；EAE+PBS组：从造模第1天即给予等量的PBS腹腔注射，直至处死。健康对照组为健康C57小鼠，从实验第1天开始腹腔给予0.2 mL的PBS溶液注射。

1.3 动物发病情况观察 从免疫当天起，两人双盲法每天观察小鼠状态并测量体重，借鉴经典的Kono[9]评分标准对小鼠进行行为学评分：0分，无症状；1分，尾部无力；2分，后肢无力；3分，后肢完全瘫痪；4分，后肢瘫痪并累及前肢；5分，垂死或死亡。神经功能缺损症状介于两标准之间者以±0.5分计算。

1.4 脑组织病理形态检测 于发病高峰期，断头取小鼠脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片烘干后进行苏木素-伊红(HE)染色。切片于二甲苯脱蜡，梯度乙醇分化，自来水冲洗，苏木精染色，1%盐酸乙醇分化，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后，光镜下观察脑组织炎性浸润情况。每只小鼠随机选取3张切片，每张切片随机选取3个视野，双盲法进行炎性评分：0分，无炎性细胞浸润；1分：少量分散的炎性细胞浸润；2分，“血管套袖”样炎性细胞浸润；3分，大量“血管套袖”形成及广泛组织炎性细胞浸润。

1.5 细胞因子检测 于发病高峰期，眼球取血，静置2 h后高速离心10 000 g/min取上层血清，-80 ℃保存备用。取冰冻血清放置于4 ℃冰箱中，严格按照试剂盒说明书，应用IFN-γ、IL-12、IL-17 酶联免疫试剂盒，检测血清细胞因子含量。

2 结果

2.1 各组动物发病情况比较 健康对照组没有发病，小鼠的体重稳步上升。EAE+PBS组小鼠多于免疫后第13天开始发病，平均发病时间为(13.01±0.16) d，高峰期体重为(14.81±0.04) g。EAE+LDN组小鼠多于免疫(16.04±0.15) d开始发病，起病时间较EAE+PBS组小鼠延迟(P<0.05)，而高峰期体重为(16.40±0.04) g，体重下降较EAE+PBS组减轻(P<0.05)。见图1。

2.2 各组动物行为学评分 健康对照组没有发病，行为学评分为0分。EAE+PBS组小鼠发病前期表现出进食减少、活动减少等症状，发病高峰期表现为尾部无力、后肢瘫痪，被动翻身不能，甚至出现垂死状态，高峰期行为学评分为(3.32±0.05)分。EAE+LDN组小鼠发病前期也表现出进食减少、活动减少等症状，但症状较EAE+PBS组明显减轻，发病高峰期表现为尾部无力，严重者出现后肢瘫痪，高峰期行为学评分为(1.70±0.05)分，较EAE+PBS组小鼠延缓(P<0.05)。见图2、图3。

图2 各组动物行为学评分比较

2.3 各组动物脑组织病理比较 健康对照组小鼠的脑组织病理HE染色未见到炎性细胞的浸润。与健康对照组相比，EAE+PBS组发病高峰期脑组织中可见大量炎性细胞浸润，主要累及白质，小血管扩张，炎性细胞围绕血管周围呈“血管袖套”样浸润，以淋巴细胞浸润为主，也可见胶质细胞和巨噬细胞，炎性评分为(2.88±0.13)分；EAE+LDN组小鼠炎性浸润程度减轻，可见炎性浸润，多散在分布，“血管袖套”样浸润少见，炎性评分为(1.13±0.13)分，与EAE+PBS组相比显著降低(P<0.05)，见图4、图5。

2.4 各组动物血清细胞因子比较 健康对照组小鼠血清IL-12含量为(37.33±4.32) pg/mL，EAE+PBS组为(376.1±12.19) pg/mL，较健康对照组小鼠血清IL-12含量显著升高(P<0.05)，而EAE+LDN组为(153.81±7.53) pg/mL，较EAE+PBS组显著下降(P<0.05)。健康对照组小鼠血清IFN-γ含量为(63.93±9.32) pg/mL，EAE+PBS组为(575.31±9.23)pg/mL，较对照组显著升高，EAE+LDN组为(349.6±9.33)pg/mL，较EAE+PBS组显著下降(P<0.05)。健康对照组小鼠血清IL-17含量为(24.07±4.28) pg/mL，EAE+PBS组为(153.41±7.31)pg/mL，较健康对照组显著升高(P<0.05)，而EAE+LDN组为(72.44±3.79)pg/mL，较EAE+PBS组显著下降(P<0.05)。

图3 各组动物发病高峰期图片

图4 各组动物脑组织病理比较(200×)

图5 各组炎性评分比较

3 讨论

MS是一种累及中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的自身免疫性脱髓鞘性疾病[10]。虽然其病因尚未明确，目前普遍认为MS中的免疫调节是多因素的，涉及遗传易感性、表观遗传学、后基因组事件及环境因素[11-12]，免疫机制主要为外周异常激活的髓鞘抗原特异性CD4+T淋巴细胞穿过受损的血-脑脊液屏障(Blood-brain barrier，BBB)进入CNS，诱发异常的免疫应答级联反应，并最终导致炎性细胞浸润等病理改变[13]。

纳曲酮是一种长效的非选择性阿片受体拮抗剂，由环丙甲基取代二氢吗啡酮氮位点的甲基。其主要作用是阻断快感促进m、d阿片受体，对k阿片样物质受体的阻断作用较小。相比于其他阿片受体，LDN具有持续时间长、效果好、可口服、亲和性高、无依赖和不产生耐受等特点，1984年被FDA批准用于治疗鸦片剂成瘾。1次/d体外给予LDN，能够间断阻断阿片类受体，并抑制细胞增殖。已有研究证实，LDN在克罗恩病和纤维肌痛等多种自身免疫性疾病的治疗中安全有效[14-15]。针对LDN对EAE模型的研究，国内外存在不同的观点。国外有研究认为，LDN不能缓解EAE病情，但可以降低模型脊髓内的CD3+/CD4+T细胞比值[16]；还有研究显示，低剂量的LDN可不同程度地减轻EAE病情，改善模型体内的炎症情况[17]。用LDN治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的小鼠，可以改善进展性EAE的结局，注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)建立小鼠EAE模型，每天给予0.1 mg/kg的LDN，疾病临床发作开始的时间延迟，行为缺陷减少，小鼠的脊髓病理显示，星形胶质细胞和脱髓鞘的面积减少。LDN治疗复发缓解型的EAE小鼠表明，内源性阿片类物质抑制疾病的进展。因此，本研究通过诱导EAE模型，体外给予低剂量的LDN干预，观察LDN对EAE模型的治疗作用。

本研究显示，EAE+PBS组小鼠发病前期出现进食减少、活动减少等症状，发病高峰期表现为尾部无力、后肢瘫痪，被动翻身不能，甚至出现垂死状态；而EAE+LDN组小鼠发病前期也表现出进食减少、活动减少等症状，但高峰期症状较EAE+PBS组明显减轻，发病高峰期多表现为尾部无力，严重者出现后肢瘫痪。EAE+LDN组小鼠起病时间较EAE+PBS组明显延迟，高峰期体重下降也减轻，高峰期行为学评分也显著下降。鉴于免疫因素在EAE疾病中的重要作用，本研究应用HE染色观察颅内炎性细胞浸润情况。脑组织HE染色可见，EAE+PBS组出现大量炎性细胞浸润，小血管扩张，出现“血管袖套”样浸润；而EAE+LDN组小鼠炎性浸润程度较轻，可见炎性浸润，多散在分布，“血管袖套”样浸润少见，并且炎性评分显著低于EAE+PBS组，提示LDN可以显著改善EAE模型颅内炎性浸润情况。随后，笔者深入研究各模型体内致炎性细胞因子分泌情况，结果显示，LDN可显著降低IL-12、IFN-γ、IL-17含量，印证了之前行为学及组织病理学分析的结果。并且，国外有临床研究表明，针对MS患者，应用LDN可显著改善患者的生活质量及心理状况，与本研究一致。Cree等[18]经过连续8周的临床实验，证实纳曲酮4.5 mg/d是可以提高生活质量的安全剂量，而Sharafaddinzadeh等[19]报道了LDN连续17周治疗的安全性，并建议关于临床安全性应该进行更长时间的研究。有研究表明，LDN可显著改善MS患者的疲劳症状，提示上调的阿片类物质系统和疲劳之间有潜在的联系。Gironi等[20]报道，在LDN治疗开始的1、3、6个月，β-内啡肽水平升高，LDN停药后的1个月，β-内啡肽水平仍保持升高，但没有报道其是否恢复到治疗前的水平。本研究结果表明，LDN可通过减轻颅内炎性浸润，减少体内Th1、Th17细胞因子分泌，明显缓解EAE模型的发病状况。本研究也存在很多不足，如LDN是否可以改善体内脾及CNS单核细胞中Th1、Th17失衡，以及其通过何种信号通路机制改善疾病仍然未知，需要深入研究。

综上所述，LDN可以通过调控免疫反应改善EAE病情，为LDN在临床中治疗MS提供理论指导，但是仍有很多调控机制亟待解决。随着对LDN作用机制的深入研究，期待其对临床上针对MS的治疗产生重要影响。

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A preliminary study of low-dose naltrexone in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis

WANG Cai-ling,XU Xu-xu,FENG Juan*

(Department of Neurology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To observe the effect of low-dose naltrexone (LDN) on the pathogenesis and the inflammatory response of mice model with the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE),and explore whether LDN had a protective effect on EAE mice.Methods Thirty C57 mice were randomly divided into EAE+LDN group,EAE+PBS group and healthy control group.EAE+LDN group was injected with 0.2 mL LDN (0.1 mg/kg) intraperitoneally,EAE+PBS group

intraperitoneal injection of equal volume of PBS,and healthy control group was unimmunized.The onset time of the disease,body weight and behavioral score were observed in the three groups.Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the infiltration of inflammatory cells in the brain tissue of mice,and the level of pro-inflammatory cytokines in serum was monitored by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results LDN could significantly delay the onset time of EAE mice,and alleviate the weight loss and the neurological dysfunction during the process of disease.The intervention of LDN could effectively reduce the inflammatory reaction in the brain tissue of EAE mice by HE staining and decrease the expression of IFN-γ,IL-12 and IL-17 in serum.Conclusion LDN can alleviate the symptoms of EAE model significantly,and reduce the inflammatory reaction in the process of EAE disease.

Multiple sclerosis;EAE;LDN;Inflammatory response

2017-02-24

中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708002